盧延華，管博文，劉旭，呂穎，王衛(wèi)，魏強，孟愛民

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術研究中心，北京 100021)

目前，越來越多的研究證明細胞衰老與疾病的發(fā)生發(fā)展關系密切[1]，而腦內(nèi)細胞的衰老與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關系也逐漸得到研究者的關注[2-3]。星形膠質(zhì)細胞是腦內(nèi)存在數(shù)量最多的細胞類型，疾病損傷會使星形膠質(zhì)細胞衰老，星形膠質(zhì)細胞出現(xiàn)功能障礙時對大腦的結構和功能具有較大的影響，一方面結構支持功能喪失，另一方面也通過分泌衰老相關分泌表型(senescence-associated secretory phenotypes，SASP)、降低神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌改變腦內(nèi)微環(huán)境損傷神經(jīng)細胞[4-5]。另外，神經(jīng)退行性疾病和腦卒中多發(fā)于中老年人，目前仍然缺乏有效治療，隨著再生醫(yī)學的發(fā)展，從上世紀末開始進行干細胞治療的實驗研究，大量的動物實驗表明通過移植干細胞可有效改善疾病癥狀[6]，但老年動物模型療效比年輕動物模型差[7]，說明不同的大腦微環(huán)境會對干細胞的功能產(chǎn)生影響，降低干細胞療效。本研究模擬老年大鼠體內(nèi)星形膠質(zhì)細胞衰老，建立大鼠星形膠質(zhì)細胞衰老模型，檢測衰老的星形膠質(zhì)細胞是否對胎鼠端腦神經(jīng)干細胞增殖產(chǎn)生影響，用以探討衰老的星形膠質(zhì)細胞所導致的腦組織微環(huán)境的改變是否可以影響干細胞的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠孕15 d胚胎及出生1 d新生鼠，購于北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2014-0004】。本實驗通過了實驗動物倫理審查會審批(IACUC號：MAM19001)。

1.1.2 試劑與儀器

DMEM/F12 HEPES培養(yǎng)基(Gibco，11330032)，B27(Gibco，17504044)，NEAA(Gibco，11140050)，N2添加劑(invitrogen，17502048)，rat EGF(peprotech，400-25-20)，rat bFGF(peprotech，400-29-10)，L-谷氨酰胺(solarbio，G0200)，青鏈霉素(碧云天，C0222)，F(xiàn)BS(hyclone，SH30406.05)，30% H2O2(天津市大茂化學試劑)，0.25% trypsin(hyclone，SH30042.01)，accutase消化酶(gibco，A1110501)，Poly-D-lysine hydrobromide(PDL，sigma，P0296)，細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒(β-gal，碧云天，C0602)，Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein(GFAP)antibody(R&D，MAB1195)，Anti-nestin Antibody(chemicon，MAB353)，Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody, Alexa Fluor 594(invitrogen，R37117)，Goat anti-Rat IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594(invitrogen，A11007)，封閉用正常山羊血清工作液(北京中山金橋生物科技公司，ZLI9056)，MTT(Thermo Fisher，M6494)。

熒光顯微鏡(leica，DMi8，德國)，酶聯(lián)免疫檢測儀(Thermo Fisher，51119200，美國)，countstar自動細胞計數(shù)儀(上海睿鈺生物科技有限公司，IC-1000，中國)。

1.2 方法

1.2.1 原代細胞分離及純化

新生大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞(astrocyte，AS)[8]：取新生鼠大腦，剪去嗅球、小腦和腦干，夾取皮層機械剪碎呈乳糜狀，加入0.25% trypsin 37℃消化15 min，待組織呈絮狀時加入10% FBS/DMEM終止消化，1000 r/min離心7 min，棄上清，以AS培養(yǎng)基(DMEM/F12+10% FBS+1% L-谷氨酰胺+1%雙抗)重懸，過濾并計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為1 × 106/mL，接種在事先用PDL包被過的 25T培養(yǎng)瓶中，細胞貼壁生長，4 h后更換培養(yǎng)基，之后連續(xù)培養(yǎng)數(shù)天，待細胞長滿基本融合，置37℃恒溫搖床以200 r/min振搖4 h進行純化，棄去培養(yǎng)基，加入0.25% trypsin消化5 min，收集細胞懸液，1500 r/min離心5 min，棄上清，AS培養(yǎng)基重懸并繼續(xù)培養(yǎng)至第3代備用。

胎鼠端腦神經(jīng)干細胞(neural stem cell，NSC)[9]：取胎鼠大腦，剪去嗅球、小腦和腦干，機械剪碎呈乳糜狀，加入accutase消化15 min，待組織呈絮狀時1000 r/min離心7 min，棄上清，以NSC增殖培養(yǎng)基(DMEM/F12+2% B27+20 ng/mL EGF+20 ng/mL bFGF+1% L-谷氨酰胺+1%雙抗+1% N2添加劑+1% NEAA)重懸，過濾并計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為1 × 106/mL，接種在25T培養(yǎng)瓶中，細胞懸浮生長，第2天換液，繼續(xù)培養(yǎng)至第3代備用。

1.2.2 細胞免疫熒光檢測

膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)是AS的特異性蛋白，是一種胞漿內(nèi)絲狀蛋白；巢蛋白(nestin)表達于胞漿，是NSC的特征性蛋白。將第3代AS和NSC分別制備成濃度為1 × 105和1 × 106/mL的單細胞懸液，24孔板每孔加0.5 mL細胞懸液，其中加NSC的孔需事先用PDL包被，孵箱培養(yǎng)24 h，4%多聚甲醛固定15 min，0.05% TritonX-100破膜15 min，山羊血清封閉1 h，滴加稀釋200× 的一抗，4℃過夜，避光條件下滴加稀釋200 × 的相應的熒光二抗，室溫孵育1 h，DAPI封閉液封片，熒光顯微鏡下照相觀察。隨機選擇8個視野(×200)至少200個細胞計算陽性率。

1.2.3 H2O2誘導大鼠星形膠質(zhì)細胞衰老及條件培養(yǎng)基的收集

將AS濃度以1 × 105/mL接種在25T培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)48 h后，分為兩組，對照組：培養(yǎng)基更換為不含H2O2的DMEM/F12培養(yǎng)基；衰老組：培養(yǎng)基更換為含200 μmol/L H2O2的DMEM/F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h，再次更換為DMEM/F12培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)3 d或7 d，收集星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基(astrocyte conditioned medium，ACM)和衰老星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基(senescent astrocyte conditioned medium，SACM)。

1.2.4 ACM和SACM處理胎鼠端腦神經(jīng)干細胞：

96孔板每孔接種5 × 103個NSC(濃度為5 × 104/mL)，實驗按加入AS條件培養(yǎng)基的不同分5組：control組，培養(yǎng)基為NSC增殖培養(yǎng)基；ACM1組，ACM與NSC增殖培養(yǎng)基比例為1∶3；ACM2組，ACM與NSC增殖培養(yǎng)基比例為1∶2；SACM1組，SACM與NSC增殖培養(yǎng)基比例為1∶3；SACM2組，SACM與NSC增殖培養(yǎng)基比例為1∶2。培養(yǎng)3 d或7 d后，顯微鏡下照相，隨機選擇8個視野(100 ×)計算神經(jīng)球數(shù)量(/mL)，之后收集細胞懸液，制備成單細胞懸液進行計數(shù)(/mL)。

1.2.5 MTT法測大鼠星形膠質(zhì)細胞活力

將AS濃度以0、0.625 × 104、1.25 × 104、2.5 × 104、5 × 104、1 × 105/mL接種在96孔板中，每孔100 μL，設6個平行孔，分別在第1、3、5、7天進行MTT實驗，每孔加MTT溶液(10 g/L)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，選擇570 nm波長(參比波長630 nm)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值(OD)[10]。

1.2.6 β-gal染色

星形膠質(zhì)細胞誘導衰老培養(yǎng)3 d或7 d后，按試劑盒提供的方法進行β-gal染色。加入β-gal固定液室溫固定15 min，去除固定液加入β-gal染色工作液，37℃孵育過夜(無CO2)，顯微鏡下照相觀察。隨機選擇8個視野(× 200)至少200個細胞計算陽性率。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞和胎鼠端腦神經(jīng)干細胞的分離及鑒定

對培養(yǎng)至第3代的AS和NSC分別進行抗GFAP和抗nestin免疫熒光染色，結果顯示細胞表達GFAP的陽性率為(97.15 ± 1.48)%(見圖1)，細胞表達nestin的陽性率為(98.03 ± 1.36)%(見圖1)，即分離的原代大鼠AS和NSC純度均在95%以上。

2.2 大鼠星形膠質(zhì)細胞增殖活力

通過MTT法測定AS增殖活性，結果顯示不同濃度細胞接種后在第3～5天為對數(shù)生長期，增殖速度較快，之后慢慢降低，其中細胞濃度在2.5 × 104、5 × 104/mL時始終保持穩(wěn)定增長，見圖2。

圖1 大鼠原代星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)干細胞(× 200)Figure 1 Rat primary AS and NSC (× 200)

圖2 大鼠星形膠質(zhì)細胞生長曲線Figure 2 Cell growth curve of rat AS

2.2 H2O2誘導大鼠星形膠質(zhì)細胞衰老

注： A： H2O2誘導后培養(yǎng)3 d AS β-gal染色(× 200)；B： H2O2誘導后培養(yǎng)7 d AS β-gal染色(× 200)；C： H2O2誘導后培養(yǎng)3 d β-gal陽性細胞比例；D： H2O2誘導后培養(yǎng)7 d β-gal陽性細胞比例；E：H2O2誘導后培養(yǎng)3 d AS細胞數(shù)量差異；F： H2O2誘導后培養(yǎng)7 d AS細胞數(shù)量差異。與對照組相比，*P< 0.05。圖3 H2O2誘導星形膠質(zhì)細胞衰老Note. A, Stained with β-gal 3 days after H2O2 induction (× 200). B, Stained with β-gal 7 d after H2O2 induction (× 200). C, Percent of β-gal+ cells 3 d after H2O2 induction. D, Percent of β-gal+ cells 7 d after H2O2 induction. E, Number of AS 3 d after H2O2 induction. F, Number of AS 7 d after H2O2 induction. Compared with control group,*P< 0.05.Figure 3 Senescent AS induced by H2O2 exposure

AS經(jīng)H2O2誘導后，衰老細胞胞體變大呈扁平狀，β-gal染色陽性(見圖3A、B)，與對照組相比，培養(yǎng)3 d和7 d后β-gal陽性細胞數(shù)分別增加(16.95 ± 1.93)%、(68.40 ± 4.16)%(見圖3C、D)，AS細胞數(shù)量分別減少(24.27 ± 1.56)%、(41.10 ± 2.22)%(見圖3E、F)，差異均有顯著性(P﹤0.05)，提示200 μmol/L H2O2誘導4 h能夠使AS衰老，結果見圖3。

2.3 衰老大鼠星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基對胎鼠端腦神經(jīng)干細胞短期增殖能力的影響

為觀察衰老AS對NSC短期增殖能力的影響，分別收集連續(xù)培養(yǎng)3 d和7 d的ACM和SACM，以不同的比例加入NSC增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3 d后對NSC的增殖情況進行檢測。

結果顯示，加入3 d條件培養(yǎng)基，ACM2組、SACM1組和SACM2組均可使神經(jīng)球數(shù)量減少(P< 0.05)，條件培養(yǎng)基的含量越高，神經(jīng)球數(shù)量越少，直徑越大，見圖4A、B。消化為單個細胞計數(shù)結果顯示，ACM組神經(jīng)干細胞的數(shù)量變化沒有顯著性差異，而SACM1組神經(jīng)干細胞數(shù)量降低(18.13 ± 5.49)%；SACM1組與ACM1組相比降低(22.99 ± 5.43)%，SACM2組與ACM2組相比降低(18.98 ± 3.57)%，差異均具有顯著性(P<0.05)，見圖4C。

注：A：3 d條件培養(yǎng)基培養(yǎng)NSC 3 d后增殖情況(× 200)。B： 神經(jīng)球數(shù)量的變化。C： NSC總數(shù)量的變化。與對照組相比，aP< 0.05；與ACM1(ACM∶NSC為1∶3)組相比，bP< 0.05；與ACM2(ACM∶NSC為1∶2)組相比，cP< 0.05；與SACM1(SACM∶NSC為1∶3)組相比，dP< 0.05。圖4 3 d條件培養(yǎng)基對NSC短期增殖功能的影響Note. A, Proliferation of NSC cultured for 3 ds (× 200). B, Number of neurosphere. C, Number of NSC. Compared with control group,aP< 0.05. Compared with ACM1(ACM:NSC=1∶3) group,bP< 0.05. Compared with ACM2(ACM:NSC=1∶2) group,cP< 0.05. Compared with SACM1(SACM:NSC=1∶3) group,dP< 0.05.Figure 4 Effects of 3 d conditioned medium on short-term proliferation of NSC

加入7 d條件培養(yǎng)基，ACM或者SACM均可使神經(jīng)球數(shù)量減少(P< 0.05)，條件培養(yǎng)基的含量越高，神經(jīng)球數(shù)量越少，直徑越大，見圖5A、B。消化為單個細胞計數(shù)結果顯示，ACM2組神經(jīng)干細胞數(shù)量增加(22.21 ± 7.02)%，SACM2組降低(24.25 ± 6.93)%；SACM1組和SACM2組與ACM2組相比分別降低(13.48 ± 3.10)%、(38.02 ± 5.67)%，SACM2組與SACM1組相比降低(28.36 ± 6.55)%，差異均具有顯著性(P﹤0.05)，見圖5C。

以上結果顯示，3 d SACM對NSC短期增殖有抑制作用，7 d ACM促進NSC增殖，7 d SACM抑制神經(jīng)干細胞的增殖，并且加入SACM比例越大，抑制作用越顯著。此外，加入條件培養(yǎng)基可使神經(jīng)球數(shù)量減少，SACM比ACM抑制作用更顯著，但神經(jīng)球直徑SACM組 > ACM 組> control組。

2.4 衰老大鼠星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基對胎鼠端腦神經(jīng)干細胞長期增殖能力的影響

為觀察星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)干細胞長期增殖能力的影響，分別收集連續(xù)培養(yǎng)3 d和7 d的ACM和SACM，不同的比例加入NSC增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7 d后對NSC的增殖情況進行檢測。

結果顯示，加入3 d條件培養(yǎng)基，ACM1組、ACM2組、SACM1組和SACM2組均可使神經(jīng)球數(shù)量減少(P< 0.05)，直徑增大，但各組間無差異，見圖6A、B。消化為單個細胞計數(shù)結果顯示，ACM1組、ACM2組、SACM1組和SACM2組NSC數(shù)量分別降低(50.76 ± 2.28)%、(46.00 ± 7.34)%、(57.40 ± 3.99)%、(58.04 ± 3.11)%，差異均具有顯著性(P﹤ 0.05)，見圖6C。

加入7 d條件培養(yǎng)基，ACM1組、ACM2組、SACM1組和SACM2組均可使神經(jīng)球數(shù)量減少(P< 0.05)，直徑增大，但各組間無差異，見圖7A、B。消化為單個細胞計數(shù)結果顯示，ACM1組、ACM2組、SACM1組和SACM2組NSC數(shù)量分別降低(61.86 ± 5.34)%、(65.23 ± 2.60)%、(73.08 ± 1.90)%、(79.77 ± 3.47)%，SACM1組和SACM2組比ACM1組分別降低(29.41 ± 4.99)%、(46.97 ± 9.10)%，差異均具有顯著性(P﹤ 0.05)，見圖7C。

注: A：7 d條件培養(yǎng)基培養(yǎng)NSC 3 d后增殖情況(× 200)。B. 神經(jīng)球數(shù)量的變化。C. NSC總數(shù)量的變化。與對照組相比，aP < 0.05；與ACM1(ACM:NSC為1∶3)組相比，bP < 0.05；與ACM2(ACM:NSC為1∶2)組相比，cP < 0.05；與SACM1(SACM:NSC為1∶3)組相比，dP < 0.05。圖5 7 d條件培養(yǎng)基對神NSC短期增殖功能的影響Note. A, Proliferation of NSC cultured for 3 days (×200). B, Number of neurosphere. C, Number of NSC. Compared with control group,aP< 0.05. Compared with ACM1(ACM:NSC=1∶3) group,bP< 0.05. Compared with ACM2(ACM:NSC=1∶2) group,cP< 0.05. Compared with SACM1(SACM:NSC=1∶3) group,dP< 0.05.Figure 5 Effects of 7 d conditioned medium on short-term proliferation of NSC

注: A：3 d條件培養(yǎng)基培養(yǎng)NSC 7 d后增殖情況(× 200)。B：神經(jīng)球數(shù)量的變化。C：NSC總數(shù)量的變化。與對照組相比，aP < 0.05。 圖6 3 d條件培養(yǎng)基對NSC長期增殖功能的影響Note. A, Proliferation of NSC cultured for 7 days (× 200). B, Number of neurosphere. C, Number of NSC. Compared with control group,aP< 0.05.Figure 6 Effects of 3 d conditioned medium on long-term proliferation of NSC

注：A. 7 d條件培養(yǎng)基培養(yǎng)NSC 7 d后增殖情況(200×)；B. 神經(jīng)球數(shù)量的變化；C. NSC總數(shù)量的變化。與對照組相比，aP < 0.05；與ACM1(ACM:NSC為1∶3)組相比，bP < 0.05。圖7 7 d條件培養(yǎng)基對NSC長期增殖功能的影響Note. A, Proliferation of NSC cultured for 7 days (× 200). B, Number of neurosphere. C, Number of NSC. Compared with control group,aP< 0.05. Compared with ACM1(ACM:NSC=1∶3) group,bP< 0.05.Figure 7 Effects of 7 d conditioned medium on long-term proliferation of NSC

以上結果顯示，3 d ACM和SACM對NSC長期增殖有抑制作用，兩者抑制作用無差異；7 d ACM和SACM對NSC長期增殖有抑制作用，但SACM抑制作用大于ACM。此外，加入條件培養(yǎng)基可使神經(jīng)球數(shù)量顯著減少，ACM和SACM作用無差異，神經(jīng)球直徑無差異。

3 討論

為了探討衰老的AS是否會影響NSC功能，本研究首先在體外分離原代AS和NSC，培養(yǎng)至第3代后純度均在95%以上，符合實驗要求，之后通過200 μmol/L H2O2誘導4 h建立AS衰老模型，與Bitto等[11]研究結果相似，經(jīng)H2O2誘導后的AS可模擬體內(nèi)相似的衰老樣改變，包括形態(tài)學變化、細胞活力下降、生長周期停滯、細胞凋亡增加、β-gal染色陽性、分泌SASP等等，培養(yǎng)時間越長，衰老的AS越多，培養(yǎng)3 d后約30% AS衰老，培養(yǎng)7 d后約80% AS衰老，最后收集AS條件培養(yǎng)基檢測其對NSC增殖能力的影響。

NSC作為一種成體干細胞，是用以治療神經(jīng)退行性疾病和腦卒中最常用的干細胞類型之一，具有自我更新和多向分化能力，理論上可分化為神經(jīng)元重建損傷的神經(jīng)系統(tǒng)。哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育出現(xiàn)在胚胎發(fā)育的中后期，因此選擇15 d胎鼠分離NSC，結果顯示此種方法可成功分離NSC，且分離效率較高。增殖能力是判斷NSC功能的重要指標，第3代NSC正常情況下具有良好的增殖分裂能力，因此選擇第3代NSC培養(yǎng)3 d或7 d后檢測其短期和長期增殖能力。本研究發(fā)現(xiàn)，正常的AS條件培養(yǎng)基可促進NSC的短期快速增殖，表現(xiàn)為少量神經(jīng)球的直徑迅速增大，Wang等[12]認為是AS通過分泌IL-6、TNF-α、BDNF等細胞因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子來實現(xiàn)的。以往研究也證明在成體海馬存在內(nèi)源性NSC，當大腦受損時可刺激NSC增殖、遷移和分化以修復大腦功能[13]。但培養(yǎng)7 d時NSC數(shù)量顯著降低，提示AS雖然可以促進少量NSC快速增殖，但由于單個NSC增殖能力有限，因此表現(xiàn)為抑制作用，這可能也是神經(jīng)系統(tǒng)損傷時僅依靠內(nèi)源性NSC難以有效恢復功能的原因之一。

同時本研究還發(fā)現(xiàn)SACM抑制NSC的增殖，培養(yǎng)的時間越長、加入的比例越大，抑制作用越顯著，提示衰老AS可能通過分泌SASP、降低神經(jīng)營養(yǎng)因子含量等抑制NSC活性，并且相比ACM組，SACM組神經(jīng)球數(shù)量更少，提示由衰老AS所引起的微環(huán)境的變化更不利于大部分NSC的存活，甚至促進干細胞的凋亡[4]，目前的許多研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增長或者神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生，腦內(nèi)AS會出現(xiàn)衰老性改變，衰老的AS結構支持功能喪失，增加衰老相關分泌表型、減少神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌，改變腦內(nèi)微環(huán)境，這可能也是NSC治療老年性神經(jīng)系統(tǒng)疾病時療效不顯著的原因之一，目前AS也已成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病新的靶點[14-16]。

在NSC的應用中，NSC在腦組織中的存活率較低仍然是此類研究尚未解決的難題，研究者嘗試通過采用與神經(jīng)營養(yǎng)因子或者其他類型干細胞共移植的方式期望能夠提高干細胞的存活率[17]，大腦中復雜的微環(huán)境不僅使移植的干細胞難以存活，同時也使NSC更多地向AS方向分化，而受損腦內(nèi)衰老的AS在其中所發(fā)揮的作用仍難有定論，衰老AS對NSC分化方向的影響以及衰老AS對NSC產(chǎn)生功能影響的分子機制值得進一步探討，以便為NSC在神經(jīng)退行性疾病和腦卒中等老年病中更好的應用提供基礎數(shù)據(jù)。