婁海偉 趙 玉 林俊芳 郭麗瓊 趙仁勇*

（1 河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院 鄭州 450001 2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 廣州 510642）

蛹蟲草（Cordyceps militaris）作為一種珍貴的食藥兩用真菌，2014 年被中華人民共和國衛(wèi)生部列為新食品原料。隨著蛹蟲草基因組測(cè)序的完成[1]，Xia 等[2]在蛹蟲草基因組中發(fā)現(xiàn)了蟲草素和噴司他丁等抗癌活性成分的合成基因，而在冬蟲夏草中未發(fā)現(xiàn)相關(guān)合成基因，這使得蛹蟲草的市場(chǎng)需求量逐年增多。

類胡蘿卜素是一類廣泛存在于自然界的天然色素，具有抗氧化，抗腫瘤，預(yù)防心血管疾病等功效。然而，常用的類胡蘿卜素都是脂溶性的，不溶于水，這極大地限制了類胡蘿卜素在各領(lǐng)域的應(yīng)用。1958 年，德國科學(xué)家Friederichsen 和Engel[3]研究發(fā)現(xiàn)蛹蟲草中的黃色素為類胡蘿卜素，而且這種黃色素是水溶性的。2013 年，Dong 等[4]從蛹蟲草中分離并鑒定出4 種水溶性的新型類胡蘿卜素。蛹蟲草中水溶性的新型類胡蘿卜素的發(fā)現(xiàn)，突破了脂溶性特點(diǎn)的限制，使得蛹蟲草類胡蘿卜素的市場(chǎng)需求量急劇上升。基于此，本文旨在篩選一種食用安全且適用于蛹蟲草新型類胡蘿卜素提取的溶劑和一種無環(huán)境污染的細(xì)胞破碎方法，并通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化，獲得提取蛹蟲草新型類胡蘿卜素的最適工藝參數(shù)。

1 材料和方法

1.1 菌株與試劑

蛹蟲草17 號(hào)菌株（CM17），華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院天然產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)室提供。

葡萄糖、MgSO4·7H2O、KH2PO4，廣州化學(xué)試劑廠；維生素B1，上海源葉公司；蠶蛹粉（水溶性），Solarbio 公司；丙酮、乙醇等試劑均為分析純級(jí)。

1.2 培養(yǎng)基

PDB（Potato dextrose broth）培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、KH2PO43.0 g，自來水定容至1 000 mL，自然pH 值，滅菌（121 ℃，20 min）。

PDA（Potato dextrose agar）培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、KH2PO43.0 g、瓊脂20.0 g，自來水定容至1 000 mL，自然pH 值，滅菌（121 ℃，20 min）。

栽培培養(yǎng)基：大米20.0 g、葡萄糖0.6 g、蛋白胨0.1 g、蠶蛹粉0.1 g、KH2PO490 mg、MgSO4·7H2O 45 mg、維生素B10.3 mg、自來水30.0 mL，自然pH值，置于250 mL 的組培瓶中，滅菌（121 ℃，30 min）。

1.3 儀器與設(shè)備

MQD-S2R 振蕩培養(yǎng)箱，上海旻泉公司；LRH-70 生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GXZ智能光照培養(yǎng)箱，江南儀器廠；FD-1D-50 冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康公司；JY92-IIN 超聲波細(xì)胞破碎儀，寧波新芝生物有限公司；UV-4802S 紫外可見分光光度計(jì)，優(yōu)尼柯公司；5804R 高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf 公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 蛹蟲草液體菌種的制備 取4 ℃斜面保藏的蛹蟲草菌種CM17，接種至PDA 培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)21 d，得到活化母種。在超凈臺(tái)中，用接種刀從CM17 母種培養(yǎng)皿上取3 塊1 cm×1 cm 大小的菌塊接種于100 mL PDB 培養(yǎng)基中，25 ℃避光振蕩培養(yǎng)（150 r/min）4 d，即得蛹蟲草液體菌種。

1.4.2 蛹蟲草子實(shí)體的栽培 每個(gè)已滅菌的含有栽培培養(yǎng)基的組培瓶中接種5 mL 蛹蟲草液體菌種，20 ℃避光培養(yǎng)6 d，然后放入光照培養(yǎng)箱進(jìn)行光周期培養(yǎng)（20 ℃，12 h 光照/12 h 黑暗，光照強(qiáng)度500～1 000 lx），60 d 即可獲得成熟的新鮮蛹蟲草子實(shí)體。

1.4.3 蛹蟲草子實(shí)體樣品的制備 新鮮的蛹蟲草子實(shí)體進(jìn)行冷凍干燥，粉碎，過60 目篩備用。

1.4.4 蛹蟲草新型類胡蘿卜素的提取工藝 酸熱法提取蛹蟲草類胡蘿卜素，參考邵穎等[5]的方法。超聲波破碎法提取蛹蟲草類胡蘿卜素，參考婁海偉等[6]的方法。

1.4.5 類胡蘿卜素得率的測(cè)定 蛹蟲草類胡蘿卜素得率的測(cè)定，參考Yang 等[7]的方法。按公式（1）計(jì)算。

式中，A——稀釋后的提取液在447 nm 波長下的吸光值；V——溶劑用量，mL；D——提取液的稀釋倍數(shù)；W——蛹蟲草子實(shí)體干重，g。

1.4.6 提取溶劑的優(yōu)化 根據(jù)前人的研究報(bào)道[4，7-8]，選取乙酸乙酯、氯仿、石油醚、乙醚、丙酮、水和乙醇作為提取溶劑，以類胡蘿卜素得率為指標(biāo)，旨在選取一種安全、無毒的提取溶劑。由于蛹蟲草類胡蘿卜素較易溶于乙醇水溶液，因此選擇了50%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇作為提取溶劑。提取條件為：料液比1∶30，提取時(shí)間30 min，提取溫度37℃。

1.4.7 超聲波破碎法和酸熱法提取類胡蘿卜素分別采用超聲波破碎法、酸熱法[5]、無超聲無酸熱法（即不采用超聲波破碎和酸熱處理的方法；提取條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1∶30、提取時(shí)間30 min、提取溫度37 ℃）等3 種方法提取蛹蟲草子實(shí)體中的類胡蘿卜素，比較3 種提取方法的類胡蘿卜素得率。

1.4.8 類胡蘿卜素提取的單因素試驗(yàn) 以類胡蘿卜素得率為指標(biāo)，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)（0～100%）、料液比（1∶10～1∶100）、超聲時(shí)間（0～30 min）、提取時(shí)間（0～90 min）、提取溫度（4～80 ℃）、超聲波功率（100～600 W）對(duì)類胡蘿卜素得率的影響。

1.4.9 類胡蘿卜素提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度為自變量（Xi），類胡蘿卜素得率為響應(yīng)值（Y），進(jìn)行Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)[9]。根據(jù)單因素試驗(yàn)設(shè)定因素水平編碼表（表1）。

表1 因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of experimental design

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用軟件Origin 9.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖形制作；采用軟件Desigin-expert 8.0.6 進(jìn)行Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲草子實(shí)體

經(jīng)栽培獲得的蛹蟲草菌株CM17 的子實(shí)體見圖1。蛹蟲草作為一種新食品原料，其子實(shí)體的顏色為橙黃色，且蛹蟲草黃色素已被鑒定為新型類胡蘿卜素[4]，這表明蛹蟲草是一種可食用的新型類胡蘿卜素資源。

圖1 蛹蟲草CM17 的子實(shí)體Fig.1 Fruiting bodies of C.militaris CM17

2.2 提取溶劑的優(yōu)化結(jié)果

圖2 溶劑對(duì)蛹蟲草類胡蘿卜素得率的影響Fig.2 Effect of solvents on the yield of C.militaris carotenoids

不同溶劑對(duì)蛹蟲草類胡蘿卜素提取效果的影響見圖2。由圖2 可知，采用50%乙醇溶液提取蛹蟲草類胡蘿卜素的得率最高，顯著優(yōu)于水、無水乙醇的提取效果，說明乙醇水溶液更適合蛹蟲草子實(shí)體中類胡蘿卜素的提取，這與婁海偉等[6]的研究結(jié)果一致。其它溶劑提取蛹蟲草類胡蘿卜素的得率大小依次為丙酮＞水＞乙酸乙酯＞氯仿＞無水乙醇＞乙醚＞石油醚。丙酮的提取效果僅次于50%乙醇，表明丙酮也較適合蛹蟲草類胡蘿卜素的提取，這與Yang 等[7]、張志軍等[10]、王陶等[11]的研究結(jié)果一致。相對(duì)于丙酮、氯仿、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，乙醇溶液不僅提取蛹蟲草類胡蘿卜素的得率高，而且在食品工業(yè)中應(yīng)用也較安全。因此，本文選取乙醇溶液作為蛹蟲草類胡蘿卜素的最適提取溶劑。

2.3 超聲波破碎法和酸熱法的比較結(jié)果

超聲波破碎法和酸熱法對(duì)蛹蟲草類胡蘿卜素提取效果的影響見圖3。

由圖3 可知，酸熱法提取類胡蘿卜素的得率顯著高于無超聲無酸熱法，這是由于酸熱處理能夠破壞蛹蟲草的細(xì)胞壁，使胞內(nèi)物質(zhì)（包括色素）溶出[10]。而超聲波破碎法提取類胡蘿卜素的得率顯著高于酸熱法，這表明超聲波對(duì)蛹蟲草細(xì)胞的破碎效果更佳。細(xì)胞破碎越徹底，原料與溶劑的接觸面積越大，則類胡蘿卜素的得率越高[12]。此外，超聲波的空化效應(yīng)能夠促進(jìn)溶質(zhì)的溶出，并提高溶質(zhì)的得率[13-14]。由于酸熱法使用鹽酸，基于環(huán)境保護(hù)和減少化學(xué)品污染考慮，選擇了更環(huán)保的超聲波破碎法提取蛹蟲草類胡蘿卜素。

圖3 超聲波破碎法和酸熱法對(duì)類胡蘿卜素得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic fragmentation method and thermal-acid method on the yield of C.militaris carotenoids

2.4 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)類胡蘿卜素得率的影響 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)類胡蘿卜素得率的影響見圖4a。由圖4a 可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，類胡蘿卜素的得率先升高后降低，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，類胡蘿卜素得率達(dá)到最大值，這與婁海偉等[6]的研究結(jié)果一致。因此，70%乙醇溶液較適合蛹蟲草中新型類胡蘿卜素的提取。

2.4.2 料液比對(duì)類胡蘿卜素得率的影響 料液比對(duì)類胡蘿卜素得率的影響見圖4b。由圖4b 可知，隨著提取溶劑體積的增大，類胡蘿卜素得率顯著增高。當(dāng)料液比達(dá)到1∶60 后，類胡蘿卜素的得率趨于平緩，且無顯著增加趨勢(shì)，表明溶劑量已充足。這一變化趨勢(shì)與趙剛等[15]的研究結(jié)果一致。因此，考慮到生產(chǎn)成本，選擇料液比1∶60 較合適。

2.4.3 超聲波破碎時(shí)間對(duì)類胡蘿卜素得率的影響 超聲波破碎時(shí)間對(duì)類胡蘿卜素得率的影響見圖4c。由圖4c 可知，在0～20 min 內(nèi)，類胡蘿卜素得率隨著破碎時(shí)間的延長而顯著增加，這可能歸因于細(xì)胞破碎程度的逐漸增強(qiáng)。當(dāng)破碎時(shí)間大于20 min 后，類胡蘿卜素的得率無顯著增加，表明細(xì)胞已破碎完全[16]。因此，選擇20 min 的超聲波破碎時(shí)間較適宜。

圖4 不同單因素對(duì)類胡蘿卜素得率的影響Fig.4 Effects of different factors on the yield of C.militaris carotenoids

2.4.4 提取時(shí)間對(duì)類胡蘿卜素得率的影響 提取時(shí)間對(duì)類胡蘿卜素得率的影響見圖4d。在15 min內(nèi)，類胡蘿卜素得率隨提取時(shí)間的延長顯著升高。而30 min 后，隨著提取時(shí)間的延長，類胡蘿卜素得率逐漸降低，這可能是由類胡蘿卜素氧化導(dǎo)致[17]。因此，攪拌提取15～30 min 較合適。

2.4.5 提取溫度對(duì)類胡蘿卜素得率的影響 提取溫度對(duì)類胡蘿卜素得率的影響見圖4e。由圖4e 可知，在4～50 ℃之間，隨著提取溫度的升高，類胡蘿卜素得率顯著增加，這可能是由于溫度升高，傳質(zhì)速率增大，從而使類胡蘿卜素得率增加[18]。而當(dāng)提取溫度高于50 ℃時(shí)，類胡蘿卜素得率顯著降低，這可能是因?yàn)楦邷卮龠M(jìn)類胡蘿卜素的氧化降解[19]。因此，提取溫度選擇50 ℃較適宜。

2.4.6 超聲波功率對(duì)類胡蘿卜素得率的影響 超聲波功率對(duì)類胡蘿卜素得率的影響見圖4f。由圖4f 可知，在100～500 W 之間，隨著超聲波功率的增大，類胡蘿卜素得率逐漸升高，當(dāng)超聲波功率為500 W 時(shí)，得率達(dá)到最大值，這表明超聲波破碎細(xì)胞可顯著促進(jìn)溶質(zhì)的提取[20-21]。當(dāng)超聲波功率大于500 W 時(shí)，類胡蘿卜素得率顯著降低，表明過高的超聲波功率會(huì)降解類胡蘿卜素，并導(dǎo)致其得率降低[22-24]。因此，選擇500 W 的超聲波功率較適宜。

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 模型方程的建立 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表2。經(jīng)回歸分析得到回歸模型方程：Y=-6500.86+197.35X1+18.87X2+71.32X3+0.17X1X2+0.25X1X3-0.08X2X3-1.47X12-0.44X22-0.80X32。

Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方差分析見表3。由表3 可知，本研究所得回歸模型極顯著（P＜0.0001），失擬不顯著（P=0.8688），決定系數(shù)R2為0.9917，表明該模型擬合較好，能充分反映自變量與類胡蘿卜素得率之間的關(guān)系。根據(jù)方差分析，將差異不顯著的因子剔除后得到的回歸方程：Y=-6406.56+197.35X1+15.10X2+69.44X3+0.17X1X2+0.25X1X3-1.47X12-0.44X22-0.80X32。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and results

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance of regression model

2.5.2 自變量對(duì)響應(yīng)值的影響 響應(yīng)值受到回歸方程的回歸系數(shù)影響。由表3 可知，X1，X2，X3，X1X2，X1X3，X12，X22，X32項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值均有顯著影響，而X2X3影響不顯著。固定3 個(gè)因素中的1 個(gè)因素在0 水平，得出其余2 個(gè)因素的交互作用對(duì)類胡蘿卜素得率影響的響應(yīng)面圖，見圖5。由圖5 可知，因素與響應(yīng)值呈拋物線關(guān)系，任何兩個(gè)因素的交互作用都存在最大的響應(yīng)值，表明各因素所選取的范圍較合理。

圖5 各因素交互作用對(duì)類胡蘿卜素得率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots for the interactive effects of various factors on the yield of carotenoids

2.5.3 最適提取條件 采用Design-Expert 軟件優(yōu)化類胡蘿卜素的最適提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)73.4%，提取時(shí)間30.4 min，提取溫度54.4 ℃。在此條件下，類胡蘿卜素得率的預(yù)測(cè)值為2 969.23 μg/g，而驗(yàn)證試驗(yàn)的實(shí)測(cè)值為（3 017.31±34.60）μg/g，預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間的相對(duì)誤差為1.59%，差異不顯著，證實(shí)了該模型的實(shí)用性和準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

以蛹蟲草子實(shí)體為原料，通過比較7 種提取溶劑，確定了可食用的乙醇溶液最適合蛹蟲草新型類胡蘿卜素的提取。超聲波破碎法提取蛹蟲草類胡蘿卜素的得率顯著高于傳統(tǒng)的酸熱法，且無環(huán)境污染。經(jīng)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化得到蛹蟲草子實(shí)體中新型類胡蘿卜素的最適提取工藝參數(shù)：乙醇體積分?jǐn)?shù)73.4%，料液比1∶60，超聲波功率500 W，超聲波處理時(shí)間20 min，提取溫度54.4℃，提取時(shí)間30.4 min。在此優(yōu)化條件下，類胡蘿卜素得率可達(dá)3 017.31 μg/g。本研究為蛹蟲草的深加工提供了一種高效、（食用）安全、無環(huán)境污染的新型類胡蘿卜素提取工藝參數(shù)，具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。