李愛玲，趙秋媛，周麗波，楊 敏，張艷麗，張麗珠，王紅斌

(1.云南民族大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650500； 2.云南民族大學(xué) 民族醫(yī)藥學(xué)院，云南 昆明 650500)

Hg2+是一種極具生理毒性的化學(xué)物質(zhì), 溶解態(tài)的Hg2+往往具有較高的化學(xué)活性，是排入天然水體中汞污染物的主要存在形式，其化合物具有較高的水溶性，也是各種汞形態(tài)轉(zhuǎn)化的樞紐.它對(duì)于人體蛋白中的硫醇組織和一些酶類都有非常高的親和性，從而導(dǎo)致不同的嚴(yán)重疾病，人類主要通過自然界的水接觸到汞污染[1],危害人類的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟、口腔以及皮膚等，甚至引起死亡[2-3].它具有持久性、易遷移性和高度的生物富集性[4],且毒性很大極易揮發(fā)，給生態(tài)系統(tǒng)帶來較大的污染[5].所以，汞元素被列入全球環(huán)境監(jiān)控系統(tǒng)中，其在生物體內(nèi)及環(huán)境中的檢測(cè)方法受到人們的極大關(guān)注.因此，開發(fā)操作簡(jiǎn)便、選擇性好、靈敏度高且成本低廉的汞離子檢測(cè)方法有非常重要的意義[6].

目前，檢測(cè)Hg2+的方法較多，但這些分析方法存在著操作方法復(fù)雜、測(cè)試時(shí)間長(zhǎng)、需用到大型儀器等缺點(diǎn)[7].紫外-可見吸收光譜，統(tǒng)稱為電子光譜，是材料在吸收10～100 nm光波波長(zhǎng)范圍的光子所引起分子中電子能級(jí)躍遷時(shí)產(chǎn)生的吸收光譜.紫外-可見吸收光譜法具有操作簡(jiǎn)便、快速，靈敏度高[8-9]，運(yùn)用與測(cè)量范圍廣泛，儀器簡(jiǎn)單價(jià)格相對(duì)較低，易于普及推廣等特點(diǎn)[10].高半胱氨酸又稱同型半胱氨酸是人體內(nèi)含硫氨基酸的一個(gè)重要的代謝中間產(chǎn)物[11]，是維持細(xì)胞和組織生長(zhǎng)，以及生物氧化還原平衡的重要物質(zhì)[12]，血液中 Hcy 的濃度水平被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病發(fā)病的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因子.羅丹明類探針技術(shù)近年來發(fā)展迅速，且羅丹明類化合物具有高摩爾消光系數(shù)、高熒光量子產(chǎn)率、良好的光穩(wěn)定性以及較寬的波長(zhǎng)范圍等光學(xué)性質(zhì)，特別是對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾后得到的螺環(huán)結(jié)構(gòu)羅丹明衍生物更具研究前景[13].

本文通過引入含有親汞基團(tuán)的高半胱氨酸，合成了探針Hcy-Rh6G2，建立了一種對(duì)汞離子的可視化檢測(cè)，且當(dāng)CH3OH/HEPES的體積比在 1∶1時(shí)，紫外吸收強(qiáng)度已經(jīng)接近最大.利用紫外-吸收光譜研究其對(duì)Hg2+的識(shí)別過程，發(fā)現(xiàn)對(duì)Hg2+的識(shí)別效果很好.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

二氯甲烷、乙酸乙酯、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氧化鋁粉、探針分子Hcy-Rh6G2在文獻(xiàn)[14]中合成，所有試劑均為分析純.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

UV2100紫外-可見分光光度計(jì)(日本SHIMADZU公司)；AV 400V核磁共振儀(BRUKER)；EF20 pH酸度計(jì)(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；SHZ-D循環(huán)水真空泵(鞏義市予華儀器有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 探針的性能測(cè)試

取Hcy(0.1 mmol/L)溶液 2 mL加入到裝有 2 mL 化合物RS1(0.1 mmol/L)甲醇溶液的反應(yīng)瓶中，中間體RS1按文獻(xiàn)[15]報(bào)道的方法合成.再往里面加入 2 mL化合物Rh6G2(0.1 mmol/L)，將他們混勻后在常溫下反應(yīng) 2 h，用于測(cè)試.測(cè)試的激發(fā)狹縫寬度為 2.5 nm、發(fā)射狹縫寬度為 2.5 nm、激發(fā)波長(zhǎng)為 510 nm、電壓為 400 V，探針的紫外-可見吸收光譜在HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸，pH=7.00)的緩沖溶液中測(cè)試.

1) 不同緩沖溶液中對(duì)Hg2+的檢測(cè).在水相、HEPES(pH=7.00)和Tris-HCl(pH=7.00)緩沖相中，加入 25 μmol/L的Hg2+，量為熒光溶液的20倍，其他條件都一致，反應(yīng) 24 h,測(cè)定溶液的紫外-可見吸收光譜.

2) 離子選擇性實(shí)驗(yàn).通過紫外-可見吸收光譜檢測(cè)探針對(duì)金屬離子的選擇性識(shí)別，將溶液的pH值調(diào)整為7，加入3.996 mL濃度為50 mmol/L的HEPES緩沖液，在7.996 mL CH3OH/H2O(V/V約1∶1)溶液中分別加入40 μL Cu2+、Al3+、Cd2+、Co2+、Fe3+、K+、Mn2+、Na+、Ni2+，F(xiàn)e2+、Ca2+、Mg2+、Zn2+和 400 μL的Hg2+金屬離子溶液，搖勻后，放置 24 h進(jìn)行識(shí)別檢測(cè).

3) 不同濃度的Hg2+對(duì)探針Hcy-Rh6G2紫外-可見吸收光譜的影響.取Hcy(0.1 mmol/L)水溶液 2 mL加入到裝有 2 mL Rh6G2(0.1 mmol/L)甲醇溶液的反應(yīng)瓶中，進(jìn)一步將Hcy和Rh6G2稀釋成濃度為 50 μmol/L，常溫下反應(yīng) 2 h后，加入 3.996 mL濃度為50 mmol/L的HEPES緩沖液，并逐漸增大Hg2+的濃度，搖勻后，放置 24 h，測(cè)定溶液的紫外-可見吸收光譜.

4) 陰、陽離子的干擾實(shí)驗(yàn).為了研究其他常見陰、陽離子對(duì)Hg2+的影響，進(jìn)行了其他常見陰、陽離子的干擾實(shí)驗(yàn)，分別加入其他常見離子和Hg2+到7.996 mL(VCH3OH:VH2O=1∶1)溶液中，放置 24 h，檢測(cè)體系的紫外-可見吸收光譜.

2 結(jié)果與討論

2.1 分子探針Hcy-Rh6G2性能研究

2.1.1 不同緩沖溶液對(duì)探針Hcy-Rh6G2紫外-可見吸收光譜的影響

不同緩沖溶液對(duì)探針Hcy-Rh6G2的紫外-可見吸收光譜影響進(jìn)行了測(cè)試，在水相、HEPES(pH=7.00)和Tris-HCl(pH=7.00)緩沖相中，加入Hg2+的量為熒光溶液的20倍25 μmol/L，反應(yīng) 24 h，測(cè)定溶液的紫外-可見吸收光譜.結(jié)果表明，如圖1所示，Hg2+在HEPES緩沖相中產(chǎn)生粉紅色熒光，在水相中和Tris-HCl緩沖相中幾乎沒有顏色變化.不同緩沖相下探針Hcy-Rh6G2對(duì)汞離子檢測(cè)的紫外吸收譜如圖2所示，Hg2+在HEPES緩沖相中可以引起探針紫外吸收光譜的明顯變化，吸收光譜強(qiáng)度最大，在水相中有較弱的吸收光譜產(chǎn)生，而在Tris-HCl緩沖相中幾乎無變化，說明HEPES緩沖相下探針Hcy-Rh6G2能夠更好的識(shí)別Hg2+.

2.1.2 探針Hcy-Rh6G2的離子選擇性

Rh6G2的醛基與Hcy反應(yīng)形成經(jīng)典的希夫堿結(jié)構(gòu)，因分子內(nèi)巰基較長(zhǎng)的烷基鏈所產(chǎn)生的空間位阻導(dǎo)致Hcy不能與醛基順利發(fā)生環(huán)化反應(yīng)誘導(dǎo)Rh6G2分子開環(huán).當(dāng)探針Hcy-Rh6G2加入Hg2+后，放置 24 h，如圖3所示.其中VCH3OH∶VH2O=1∶1,激發(fā)波長(zhǎng)為 510 nm.Hg2+可以引起探針紫外吸收光譜的明顯變化，吸收強(qiáng)度增加最大，加入其他常見金屬離子，除Co2+的吸收強(qiáng)度有略微變化外，其它的紫外吸收強(qiáng)度幾乎為零，表明探針分子Hcy-Rh6G2對(duì)Hg2+具有相對(duì)較高的離子選擇識(shí)別性能.

2.1.3 不同濃度的Hg2+對(duì)探針Hcy-Rh6G2的紫外-可見吸收光譜的影響

不同濃度的Hg2+對(duì)探針Hcy-Rh6G2紫外-可見吸收光譜的影響也進(jìn)行了測(cè)試，未加入Hg2+時(shí)，探針的紫外吸收強(qiáng)度幾乎為0，表明此時(shí)探針為閉環(huán)狀態(tài).如圖4所示，加入Hg2+后，在 528 nm處出現(xiàn)一個(gè)新的特征峰，且紫外吸收強(qiáng)度隨Hg2+濃度的增大而增強(qiáng)，表明探針和Hg2+已經(jīng)完全反應(yīng)，螺旋胺環(huán)已經(jīng)全部被打開，溶液顏色也由無色漸變成紫紅色.如圖 5所示，紫外吸收強(qiáng)度的增幅與Hg2+濃度呈線性關(guān)系，線性回歸方程為A=0.005 1c-0.103 2(R=0.995 3),其中c為Hg2+的摩爾濃度，A為吸光度.

2.1.4 其它陰陽離子的干擾

為考察其它金屬陽離子和陰離子對(duì)探針Hcy-Rh6G2識(shí)別Hg2+的影響，還進(jìn)行了其它金屬陽離子和陰離子的干擾實(shí)驗(yàn).在濃度為25 μmol/L的Hcy-Rh6G2溶液中加入濃度為0.1 mol/L的其它陰離子(Br-, I-, CO23, H2PO2-4, HPO-4, PO3-4, NO-2, NO-3, S2O2-3, SO2-3, SO2-4, HSO-3, HSO-4)40 μL后，如圖6所示，波長(zhǎng)為528 nm處,紫外吸收強(qiáng)度幾乎沒變化，之后再加入Hg2+，紫外吸收強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，除I-,Br-, 外，加入其他陰離子后探針的紫外吸收強(qiáng)度的增幅與單獨(dú)加入Hg2+后探針的紫外吸收強(qiáng)度的增幅相同，表明其他陰離子的存在未干擾探針對(duì)Hg2+的檢測(cè).I-,Br-的加入使得探針的紫外吸收強(qiáng)度下降，是因?yàn)镮-與Hg2+形成了四面體型[HgI4]2+,從而使Hg2+無法正常與RS1結(jié)合所致，從而使紫外吸收強(qiáng)度下降.

在濃度為25 μmol/L的Hcy-Rh6G2溶液中加入濃度為 0.1 mol/L的其他金屬陽離子40 μL后，如圖7所示，波長(zhǎng)528 nm處紫外吸收強(qiáng)度幾乎沒變化，之后再加入Hg2+，紫外吸收強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，加入其他金屬陽離子后探針的紫外吸收強(qiáng)度的增幅與單獨(dú)加入Hg2+后探針的紫外吸收強(qiáng)度的增幅相同，表明其他金屬陽離子的存在未干擾探針對(duì)Hg2+的檢測(cè).是由于Fe3+的順磁性導(dǎo)致吸收強(qiáng)度淬滅.

2.2 溶劑體系(CH3OH:HEPES)的比例對(duì)反應(yīng)的影響

從紫外吸收強(qiáng)度上看，如圖8在純甲醇或者隨HEPES緩沖液的量增加時(shí)，體系的紫外吸收強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，當(dāng)CH3OH/HEPES的體積比在 7∶1～4∶4之間時(shí)，體系的紫外吸收強(qiáng)度較強(qiáng).其中，當(dāng)CH3OH/HEPES的體積比在1∶1時(shí)，紫外吸收強(qiáng)度已經(jīng)接近最大.

2.3 探針Hcy-Rh6G2對(duì)Hg2+識(shí)別機(jī)理研究

為了探究探針Hcy-Rh6G2和Hg2+反應(yīng)機(jī)制的可能性，先將Hg2+加入到探針溶液中，打開探針內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)，形成較大的共軛體系分子，產(chǎn)生了熒光，再加入過量的絡(luò)合劑EDTA，熒光強(qiáng)度幾乎無明顯變化，表明此識(shí)別過程不可逆，且體系中有水參與反應(yīng)，證明此識(shí)別過程可能與水解有關(guān).如圖9所示，通過水解產(chǎn)物的質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，Q-TOFMS：([M+H])+理論值：415.20，觀測(cè)值：415.2013(m/z)的信號(hào).

3 結(jié)語

本文通過引入高半胱氨酸，合成了探針Hcy-Rh6G2，利用紫外-吸收光譜研究其對(duì)Hg2+的識(shí)別過程.通過紫外光譜法研究結(jié)果表明，探針分子Hcy-Rh6G2在HEPES緩沖溶液中能快速、高選擇性的識(shí)別Hg2+，當(dāng)CH3OH/HEPES的體積比在1∶1時(shí)，紫外吸收強(qiáng)度已經(jīng)接近最大，具有較強(qiáng)的抗金屬陽離子和陰離子的干擾能力，并能通過溶液顏色變化實(shí)現(xiàn)對(duì)汞離子的感官識(shí)別，在2.50×10-5～2.250 0×10-4mol/L濃度范圍內(nèi)，紫外吸收強(qiáng)度的增幅與Hg2+濃度呈線性關(guān)系，線性回歸方程為A=0.005 1c-0.103 2(R=0.995 3)，可應(yīng)用于實(shí)際樣品中Hg2+的檢測(cè).