王詩琳，孟天嬌，商慶龍

哈爾濱醫(yī)科大學微生物學教研室， 哈爾濱 150081

惡性腫瘤被稱為癌癥，表現(xiàn)為組織分化程度低，具有侵襲轉移潛力。2018年全世界新發(fā)的癌癥病例約 1 810 萬，死亡約960萬，其中，48.4%的新發(fā)病例和57.3%的死亡病例發(fā)生在亞洲[1]。在早期針對腫瘤的研究中，科學家發(fā)現(xiàn)動物腸道病毒對腫瘤具有一定殺傷作用，從而使溶瘤病毒的研究受到了關注。由于通常僅引起成人無癥狀或輕微病變[2-3]及突出的機體抗腫瘤免疫[4]，以腸道病毒為基礎的溶瘤病毒受到廣泛關注。本文針對腸道病毒的溶瘤作用研究進展進行綜述。

1 腸道病毒概況

腸道病毒(enterovirus，EV)是一類無包膜的單股正鏈RNA病毒，包括柯薩奇病毒(Coxsackievirus，CV)、脊髓灰質炎病毒(poliovirus，PV)、埃可病毒(Echovirus)以及新型腸道病毒71型(EV71)等。由于部分腸道病毒具有選擇性殺死腫瘤細胞的能力，對正常細胞影響小，所以被作為溶瘤病毒[3,5]。但是，也有研究證據(jù)支持腸道病毒能促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展。EV71可引起輔助性T細胞17(T helper cell 17，Th17細胞)在結腸癌組織中募集并刺激細胞因子白細胞介素17(interleukin-17，IL-17)的產(chǎn)生，Th17細胞和IL-17兩者在結腸癌的發(fā)生、發(fā)展以及轉移和預后中均發(fā)揮了重要作用[6-10]。因此，腸道病毒在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮何種作用，仍需更多的證據(jù)支持。

2 腸道病毒的溶瘤作用

2.1 腸道病毒作為溶瘤病毒的證據(jù)

2.1.1 經(jīng)典證據(jù) 1971年，動物腸道病毒的溶瘤現(xiàn)象首次被觀察到。研究發(fā)現(xiàn)，牛腸病毒可使小鼠Ehrlich癌性腹水減少、肉瘤團塊縮小，白血病小鼠壽命延長[11]。牛腸病毒能在多種腫瘤細胞中良好復制，產(chǎn)生致細胞病變效應[12]，使移植入家兔體內的人類腫瘤明顯減小[13]?？滤_奇病毒B(Coxsackievirus B，CVB)、豬腸病毒能在腫瘤細胞中增殖并殺傷腫瘤細胞[14]，埃可病毒也可在多種結腸癌細胞系中有效復制并殺傷腫瘤細胞[15]。

2.1.2 腸道病毒受體在腫瘤細胞表面過表達 腸道病毒受體在正常組織中低表達，在多種腫瘤組織中過表達。脊髓灰質炎病毒受體CD155在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、骨和軟組織肉瘤等多種人類腫瘤細胞表面過表達[16-17]。將脊髓灰質炎病毒減毒活疫苗作為溶瘤制劑應用時，可抑制移植上述腫瘤的實驗動物模型體內腫瘤生長[18-19]，明顯提高腫瘤發(fā)生腦轉移實驗動物的生存率，再次接種相同種類的癌細胞，也不會再引發(fā)癌癥[18]。作為柯薩奇病毒A21(Coxsackievirus A21，CVA21)的受體，細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)和衰變加速因子(decay-accelerating factor，DAF)在乳腺癌、前列腺癌、黑素瘤等細胞膜表面表達量豐富。給予小鼠CVA21后，小鼠的原位腫瘤表現(xiàn)出溶瘤現(xiàn)象，遠處腫瘤和轉移灶也被消除[20-21]，這表明溶瘤效應有量效反應作用[20]。埃可病毒主要與細胞表面的整合素α2β1的α亞單位Ⅰ區(qū)結合，能夠選擇性地破壞表達高水平整合素的前列腺癌、卵巢癌和胃癌的細胞團，顯著抑制腹水形成[22]。由于腸道病毒對受體的選擇性，特定的腸道病毒能靶向抑制特定組織來源的腫瘤[3]。

2.1.3 宿主免疫對腸道病毒的溶瘤作用無影響 有研究報道，當腸道病毒感染時，機體對腸道病毒的清除作用不影響腸道病毒的溶瘤作用。接種脊髓灰質炎病毒疫苗后機體產(chǎn)生的抗體，不會削弱腸道病毒的溶瘤效果[23]。給予黑色素瘤四期患者CVA13、15、18和21后，針對CVA21的抗體并不能交叉中和其他病毒亞型感染[24]。

2.2 腸道病毒溶瘤的作用機制

2.2.1 腸道病毒致細胞病變效應 腸道病毒感染宿主細胞后，阻斷了細胞蛋白質的生物合成過程，大量復制子代病毒，導致宿主細胞裂解，并在細胞間傳播[25]。

2.2.2 腸道病毒激發(fā)宿主抗腫瘤免疫 腸道病毒感染并裂解靶細胞后，釋放的腫瘤抗原被鄰近細胞捕獲，通過外源性人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)Ⅱ類呈遞途徑[26]，主要由CD8+T細胞介導，促進免疫細胞識別腫瘤抗原，刺激機體抗腫瘤免疫[27-28]。給予神經(jīng)母細胞瘤小鼠脊髓灰質炎病毒，腫瘤裂解后收集到的脾細胞溶瘤強度增強，主要由CD8+T細胞介導[28]。而?？刹《疽部梢酝ㄟ^該機制發(fā)揮抗腫瘤作用[29]。另一方面，在腫瘤所致的免疫抑制微環(huán)境中腸道病毒還能重新激活機體抗腫瘤免疫[30-31]，如重組溶瘤脊髓灰質炎病毒-鼻病毒嵌合體(recombinant nonpathogenic polio-rhinovirus chimera，PVS-RIPO)能激活被抑制的樹突細胞(dendritic cell，DC)和巨噬細胞，DC分泌Ⅰ型干擾素(interferon，IFN)，產(chǎn)生強烈且持久的Ⅰ型IFN反應[32-34]。PVS-RIPO還可直接裂解腫瘤細胞[35]，促進以中性粒細胞浸潤為主的天然免疫，為與獲得性免疫產(chǎn)生協(xié)同作用提供了促炎微環(huán)境[36-37]。

2.2.3 腸道病毒能夠誘導細胞凋亡 細胞凋亡信號通路包括細胞表面的受體介導的和線粒體介導的細胞凋亡信號通路。脊髓灰質炎病毒感染可同時激活上述兩條通路而誘導腫瘤細胞凋亡[19,36]。EV71感染細胞后可激活線粒體介導內在的caspase-9凋亡通路[37]和Bax誘導的細胞凋亡[38-39]。EV71的3C蛋白也能通過裂解端粒結合蛋白PinX1促進細胞凋亡[40]。

3 腸道病毒溶瘤效果的優(yōu)化策略

3.1 以提高溶瘤病毒的組織親嗜性提升安全性

安全性是溶瘤病毒的重要指標[41]。加強靶向性能提高溶瘤病毒的安全性，避免溶瘤制劑無效分布于正常組織，從而提高治療指數(shù)。全身應用天然溶瘤病毒后，溶瘤病毒在腫瘤組織中的劑量常不足以達到免疫反應所需的臨界閾值[31]。主要有兩種途徑提升組織親嗜性，首先，通過基因工程向野生型溶瘤病毒插入器官特異性的miRNA靶序列，可改變溶瘤病毒在腫瘤細胞中的趨向性和生物分布[42]；其次，通過改變溶瘤病毒的傳播及復制能力建立復制缺陷型病毒，以提高溶瘤的安全性和組織親嗜性，如溶瘤病毒在特異感染腫瘤細胞的同時，對非腫瘤細胞也產(chǎn)生不同程度的影響。利用基因工程對溶瘤病毒進行改造，達到溶瘤病毒在發(fā)揮溶瘤作用的同時少干擾鄰近正常細胞的效果。用外源基因如腫瘤抗原取代編碼脊髓灰質炎病毒衣殼的基因，制造出的RNA復制子在衣殼包被后通過與脊髓灰質炎病毒相同的機制發(fā)揮溶瘤作用，但由于其不具有編碼衣殼的基因，僅局限于單輪感染，對于低表達CD155的正常細胞殺傷作用不明顯，且劑量可控，多次注射也能保證安全性[43]。另一項經(jīng)典的研究是將脊髓灰質炎病毒的內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site，IRES)，由人類2型鼻病毒(human rhinovirus type 2，HRV2)的基因替換，構建有復制缺陷的脊髓灰質炎/鼻病毒嵌合體(PVS-RIPO)。PVS-RIPO在正常細胞中復制能力減弱，但在腫瘤中作用不變，因此，被廣泛用于溶瘤病毒的研究[44-45]。

3.2 通過變異增加溶瘤病毒的應用范圍

在腫瘤細胞表面常發(fā)生病毒特異受體下調或丟失[46]，導致溶瘤病毒的溶瘤效率低并產(chǎn)生副作用。促使病毒變異可改變受體的特異性，拓寬溶瘤病毒的應用范圍。用腸道病毒受體缺陷的細胞連續(xù)傳代病毒原型，得到的變異株有可能獲得針對該細胞系增強的感染和復制效能，擴大溶瘤病毒的應用范圍[47]。如將原型CVB3連續(xù)傳代，致使病毒衣殼中VP3的一個谷氨酸位點被谷氨酰胺取代，CVB3由此獲得結合DAF的能力，可感染柯薩奇病毒和腺病毒受體(Coxsackievirus and adenovirus receptor，CAR)缺陷但大量表達DAF的人橫紋肌瘤(rhabdomyoma，RD)細胞[48]。CVB1、CVB3、CVB5和CVB6趨向性的拓寬可能與后天獲得與DAF結合的能力有關[49]。CVA21進入細胞需同時與ICAM-1和DAF結合，而單獨結合DAF的病毒不能感染細胞[50]。如果CVA21在僅表達DAF的細胞系中多次傳代，得到的變異株CVA21-DAFv結合DAF的能力則更強，僅與DAF結合即可感染細胞。增加CVA21-DAFv的DAF受體利用率能使ICAM-1缺陷細胞快速且完全裂解，同時也保留了與ICAM-1結合的潛力[51]。

3.3 引入錘頭型核酶提升病毒復制效率

病毒復制時，去除脊髓灰質炎病毒RNA 5′端核苷酸的步驟降低了病毒的復制效率[52]。引入錘頭型核酶能去除5′端多余的核苷酸，產(chǎn)生精確的5′端轉錄本，轉錄本的復制速度顯著增加[53]。錘頭型核酶克隆的設計可能會提高溶瘤病毒用于治療的療效。

3.4 溶瘤病毒作為導入抗原基因的載體

溶瘤病毒可被改造成基因載體，攜帶抗原基因或腫瘤抗原基因。將CD8+T細胞抗原基因引入小鼠腦脊髓炎病毒(Theiler’s murine encephalomyelitis virus，TMEV)基因組中，重組病毒可誘導實驗動物產(chǎn)生大量抗腫瘤CD8+T細胞，使體內腫瘤體積縮小和生存期延長[54]。有研究采用外源基因(如腫瘤抗原取代編碼脊髓灰質炎病毒衣殼的基因)制備出重組溶瘤病毒。該重組溶瘤病毒對CD155低表達的正常細胞殺傷作用不明顯。由于無法編碼蛋白衣殼，該重組溶瘤病毒僅用于單輪感染，劑量容易控制，可以多次注射，安全性好[43]。

4 腸道病毒的臨床應用

4.1 進入臨床試驗的腸道病毒

腸道病毒適用于早期腫瘤的術后輔助治療。PVS-RIPO已應用于惡性膠質瘤的臨床試驗，能提高患者的生存率，但也存在副作用[55]。埃可病毒能顯著延長早期黑色素瘤術后患者的生存期，沒有明顯副作用[56]。CVA21、CVB3等溶瘤病毒是目前臨床試驗的重點[42]。

4.2 腸道病毒與抗癌藥聯(lián)合應用

溶瘤病毒與傳統(tǒng)化療聯(lián)合應用時呈現(xiàn)出協(xié)同作用，在一些耐化療藥物的結直腸腫瘤中，聯(lián)合治療具有顯著的抗腫瘤作用[57-58]。當CVA21與鹽酸多柔比星(阿霉素)同時使用或在鹽酸多柔比星使用前24 h注射CVA21，中等程度表達CVA21受體的細胞死亡增加。與單獨使用其中的一種相比，CVA21與鹽酸多柔比星聯(lián)合應用對于腫瘤的影響更顯著[59]。奧沙利鉑抑制腫瘤細胞DNA的復制和轉錄，但對奧沙利鉑耐藥的結腸癌患者預后較差[60]。CVA11在感染結腸癌細胞時，可有效裂解對奧沙利鉑敏感的Caco-2細胞株，而對奧沙利鉑耐藥的WiDr株幾乎沒有影響。但用奧沙利鉑預處理WiDr細胞系可使該細胞系在體內、外均被CVA11感染而裂解。聯(lián)合CVA11與奧沙利鉑治療比單獨使用其中之一更有效、更具細胞毒性[61]。派姆(Keytruda)單克隆抗體(簡稱單抗)是一種抗PD-1的抗體，能使腫瘤微環(huán)境中的T細胞數(shù)量增加，被用于惡性黑色素瘤等方面的治療[62-63]。腫瘤微環(huán)境的免疫抑制可導致針對于派姆單抗的耐藥性發(fā)生[64]。溶瘤病毒在一定程度上逆轉了腫瘤免疫抑制并可誘導抗腫瘤T細胞反應。臨床試驗證實，將CVA21與派姆單抗聯(lián)合用于晚期黑色素瘤，兩者表現(xiàn)出協(xié)同作用，可有效提高抗腫瘤活性，且患者耐受性良好[65]。

4.3 腸道病毒溶瘤作用的安全性

對于屬小RNA病毒科的腸道病毒來說，病毒變異(如毒性減弱、親嗜性改變等)需要關注。需通過基因工程技術改造病毒基因組，增加病毒復制的保真度，防止病毒毒力回復[61]。脊髓灰質炎病毒作為溶瘤病毒在膠質瘤中復制時沒有出現(xiàn)上述病毒變異[66]。溶瘤病毒載體通過患者的排泄物可能影響環(huán)境問題，也需予以關注[67]。

5 需要解決的關鍵問題

溶瘤病毒在腫瘤微環(huán)境中剛開始復制時對激活機體抗腫瘤免疫的影響，較病毒持續(xù)存在于腫瘤細胞內時更大[68]。在腫瘤微環(huán)境中，溶瘤病毒、腫瘤細胞、腫瘤微環(huán)境及宿主免疫四者之間復雜的相互作用關系仍需深入研究，為腸道病毒溶瘤機制的后續(xù)探索做鋪墊[69]。

腸道病毒在人類與嚙齒動物中的表現(xiàn)差異較大，其中，小鼠模型常缺乏免疫功能。例如，人類紅細胞表面存在CAR受體，而小鼠和恒河猴模型的紅細胞表面卻沒有，這些CAR受體能隔離柯薩奇病毒顆粒并將其快速清除[70]。該差異阻礙著溶瘤病毒研究從臨床前階段向臨床階段過渡[41]。另外，如何在保證安全性的基礎上開發(fā)出更廣譜、更具潛能的的溶瘤病毒，仍是未來需要解決的問題。

6 結語

近年來，腸道病毒與腫瘤關系的研究受到關注，在腸道病毒溶瘤作用的分子機制以及腸道病毒改造與臨床試驗等方面已取得進展，但腸道病毒與腫瘤之間的關系、腸道病毒成為溶瘤病毒的機制等仍不十分明確。改變腸道病毒的組織靶向性、增加其安全性及溶瘤效能等分子水平上的進展將提高對腸道病毒作為溶瘤病毒的深入理解，促進腫瘤的防控。另外，還需進一步明確腸道溶瘤病毒與機體的相互作用，建立合適的動物模型，開發(fā)安全性與覆蓋范圍兼具的溶瘤制劑，開展更廣泛的研究以優(yōu)化腸道病毒的溶瘤治療。