王 珍，張永利，孟勤燕，陳 雪，齊 歡，李浩浩，閆宗科

（陜西西鳳酒股份有限公司，陜西鳳翔 721406）

發(fā)酵工業(yè)中微生物菌種是發(fā)酵的核心。菌種選育在發(fā)酵工業(yè)中占有重要的地位，是決定發(fā)酵產品工業(yè)化價值及發(fā)酵進程的關鍵。大曲中富集多種微生物及其代謝產生的復雜酶系，是中國白酒傳統(tǒng)釀造工業(yè)重要的糖化劑、發(fā)酵劑和生香劑。酵母作為大曲微生物中發(fā)揮發(fā)酵原動力的關鍵菌系，與基酒的產量和質量密切相關[1]。

白酒釀造過程中，酵母分解糖分產生酒精的溫度一般低于35 ℃，溫度過高通常會引起細胞內脂肪酸、磷脂、麥角固醇等發(fā)生變化，影響細胞本身正常的生理活動，導致微生物代謝發(fā)生紊亂，生命活力下降，甚至早衰、死亡[2-3]。但根據培曲工藝的不同，培曲頂溫期曲心溫度最高達60 ℃，此時絕大部分酵母菌因不耐高溫而死亡，導致釀酒過程中酵母群落結構改變，影響白酒主體呈香及呈味物質的合成與積累[4]，不利于保持產品質量的穩(wěn)定性。目前，主要通過自然界篩選[5-6]、高溫馴化[7]、誘變育種[8]、細胞融合[9]、基因改造[10-11]等方式選育耐高溫、高產酒精酵母。但由于白酒風格特性是當地氣候、水域及香型工藝等各方面綜合作用的結果，引入外來菌種進行發(fā)酵，很可能產生不可預期的消極影響。因此，各名酒企業(yè)更期望從生產環(huán)境、大曲、酒醅等生產區(qū)域內部開展篩菌工作，篩選得到的菌株經過了長期進化，對發(fā)酵環(huán)境的適應性較強，遺傳性能也相對較穩(wěn)定。

本研究以鳳型大曲為菌種來源，采用溫度梯度結合TTC顯色、產氣結合生長曲線等三級篩方法篩選兼具耐高溫與高產酒精功能的酵母菌，并研究其發(fā)酵特性，探索其生產應用價值，以進一步完善鳳香型白酒釀造微生物功能菌菌種資源庫，為培曲強化菌種的合理搭配與使用及大曲科學化生產提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 曲樣

曲樣來自陜西西鳳酒股份有限公司701 制曲車間。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水定容至1000 mL，115 ℃滅菌30 min，滅菌結束后加入30 μg/mL硫酸鏈霉素。

分離培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂(無水) 0.5 g，瓊脂20 g，孟加拉紅0.033 g，氯霉素0.1 g，蒸餾水定容至1000 mL，121 ℃滅菌20 min。

篩選培養(yǎng)基：TTC 下層為酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1000 mL，115 ℃滅菌30 min；TTC 上層培養(yǎng)基為葡萄糖5 g，瓊脂15 g，蒸餾水定容至1000 mL，115 ℃滅菌20 min，溫度降至50 ℃時，添加TTC 溶液，使TTC終濃度為0.5 g/L。

活化培養(yǎng)基：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水定容至1000 mL，115 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：高粱與水按照1∶5 添加量，煮沸1～2 h，加入淀粉酶液化后補加60 ℃水1 份，加入5%糖化酶，攪勻，60 ℃保溫糖化3～4 h，直到用稀碘液檢驗不變藍色，再加熱至90 ℃濃縮30 min，冷卻至室溫后用紗布過濾取上清液。用蒸餾水調至18°Bé用于發(fā)酵試驗。

1.1.3 主要試劑

TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）、孟加拉紅、硫酸鏈霉素、糖化酶。

1.1.4 主要儀器與設備

生化培養(yǎng)箱、恒溫搖床、生物傳感分析儀、紫外分光光度計、pH計、高壓蒸汽滅菌鍋、移液槍等。

1.2 試驗方法

1.2.1 大曲取樣

于大曲培養(yǎng)頂溫結束后在曲房四角及對角線交叉點處，采用五點法結合四分法的取樣模式取樣，并立刻帶回實驗室。

1.2.2 分離與篩選

1.2.2.1 分離與純化

稱取10 g 大曲樣品倒入含有90 mL 富集培養(yǎng)基的三角瓶中，以30 ℃、200 r/min 恒溫富集24 h 后吸取上清液進行梯度稀釋，分別取10-3、10-4、10-5稀釋液涂布于分離培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)。當培養(yǎng)基菌落形態(tài)明顯時，挑取生長良好、菌落形態(tài)不同的酵母單菌落于YPD 平板劃線純化，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后挑取單菌落于YPD試管斜面保存。

1.2.2.2 初篩——溫度梯度結合TTC平板顯色

將分離純化得到的酵母菌點接到TTC 下層培養(yǎng)基上，分別于30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃條件下培養(yǎng)48 h，待長出菌落后倒入10 mL TTC 上層培養(yǎng)基覆蓋菌落，并于30 ℃下避光保溫3～4 h。觀察、記錄各菌株菌落顏色的深淺。每株菌做3個平行。

1.2.2.3 二級篩——高溫產氣結合生長曲線

（1）杜氏管產氣：在含有6 mL YPD液體培養(yǎng)基的試管中倒扣加入杜氏管，使其充滿培養(yǎng)基。滅菌后，按照1×106cfu/mL 接種量接入一級篩菌株活化菌懸液，并分別于30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃條件下恒溫靜置培養(yǎng)72 h。定期觀察、記錄杜氏管氣體充滿情況。每株菌3個平行。

（2）生長曲線：同杜氏管產氣法，試管液體培養(yǎng)基中不加杜氏管，30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h。定期檢測不同溫度梯度下各菌株培養(yǎng)液在590 nm 下的吸光度。繪制生長曲線。每株菌做3個平行。

1.2.2.4 三級篩——高粱汁液體發(fā)酵

使用高粱汁活化二級篩獲得的菌株，并按照1×106cfu/mL 接種量接入到100 mL 高粱汁，發(fā)酵栓密封，30 ℃恒溫培養(yǎng)，以24 h 內重量差小于0.1 g 作為發(fā)酵終止信號。綜合發(fā)酵液理化指標進行三級篩。每株菌做3個平行。

1.2.3 耐高溫高產酒精酵母模擬固態(tài)發(fā)酵試驗

使用500 mL 三角瓶進行鳳香型白酒固態(tài)模擬發(fā)酵試驗，分別以現用成熟大曲為對照，添加不同菌株組合為試驗處理，詳見表1。三角瓶中盛裝酒醅300 g，成熟曲12 g，每種菌3×108cfu。發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間27 d。

表1 模擬固態(tài)發(fā)酵試驗菌株組合方案設計

1.2.4 耐高溫高產酒精酵母菌大曲生產應用（表2）

表2 耐高溫高產酒精酵母大曲生產應用方案

曲塊入房時，將篩選獲得的耐高溫高產酒精酵母擴培后與常用菌種按照1∶1 比例噴灑在曲塊表面，同時以只噴灑常用菌種的大曲作對照。重復60房。培曲30 d 后，取樣檢測每房大曲質量指標。培曲條件同常規(guī)管理。

1.2.5 指標測定方法

高粱汁發(fā)酵失重量測定：發(fā)酵瓶稱重1次/d，記錄失重情況，繪制失重曲線；還原糖采用斐林試劑滴定法；總酸采用氫氧化鈉滴定法；pH 值使用pH計測定；總酯采用皂化回流滴定法測定[12]；乙醇產量采用生物傳感分析儀測定。

模擬固態(tài)發(fā)酵酒醅水分、酸度、還原糖、淀粉、酒精含量參照周平等[13]進行。

大曲理化指標水分、酸度、液化力、糖化力、發(fā)酵力、酯化力的測定參考釀酒大曲通用分析方法QB/T 4257—2011[14]進行。

1.3 數據處理

數據使用Excel 2016 整理，SPSS 20.0 進行單因素方差分析，Duncan 法進行顯著性比較，Origin 8.0作圖。

2 結果與分析

2.1 大曲中酵母菌的分離與篩選結果

2.1.1 大曲中酵母菌分離

由于西鳳酒為中高溫培曲，頂溫期溫度可達到55～60 ℃，此時大多酵母菌已經死亡，因此在大曲頂溫出現下降時取樣進行菌株分離，獲得耐高溫酵母的概率更大。根據培養(yǎng)基上菌落形態(tài)的差異，共分離得到56株酵母菌。

2.1.2 耐高溫高產酒精酵母的初篩分析

初篩時采用TTC 顯色與溫度梯度培養(yǎng)相結合的方法，在篩選高產酒精的酵母菌同時，根據不同溫度下菌落是否生長繁殖來判斷其耐高溫情況。鑒于酵母菌在酒醅中發(fā)酵的溫度最高為30～35 ℃之間，而培曲過程中品溫最高達55～60 ℃。綜合考慮認為，能夠在高溫環(huán)境中存活，并在低溫條件下具有產酒精能力的酵母菌即為耐高溫高產酒精酵母的初篩菌。

如圖1 舉出的菌株1#、2#、3#，根據各菌株菌落顯色深淺及菌落大小，共獲得初篩菌22 株，依次編號為Y1、Y2……Y22。其中7 株酵母（Y6、Y8、Y10、Y11、Y12、Y16、Y18）在30 ℃及35 ℃條件下TTC 顯色顏色均較深，45 ℃下雖未顯色，但有菌落生長，產酒精能力及耐高溫性能可能均較好；其余15 株菌雖顯色較淺，但在45 ℃下均有菌落生長，也可作為下一步篩選出發(fā)菌。

2.1.3 耐高溫高產酒精酵母的二級篩分析

酵母菌在有氧或無氧條件下均能消耗營養(yǎng)物質，釋放出大量二氧化碳，實現細胞的生長增殖或代謝基質的發(fā)酵。利用該原理，可以根據杜氏管中氣體充滿情況和培養(yǎng)液的吸光度變化來了解酵母菌群體在不同微環(huán)境下的代謝強度與生命活力[15]。

由各菌株在30 ℃、35 ℃、40 ℃及45 ℃下產氣量及生長曲線變化情況（見表3、圖2，Y7 菌株）發(fā)現，Y2、Y3、Y4、Y7、Y10、Y13、Y14、Y17、Y19、Y21、Y22 這11 株菌于40 ℃時，其生長曲線呈上升趨勢，24 h 或40 h 下杜氏管充滿氣體，但45 ℃生長曲線接近直線。說明其最高耐溫在40～45 ℃之間。為進一步明確各菌株耐溫點，將篩得菌分別于42 ℃和44 ℃下培養(yǎng)48 h，結果顯示Y2、Y3、Y19、Y21、Y22菌株可耐44 ℃，其余6菌株可耐42 ℃，其中Y19在44 ℃時產氣量與42 ℃相當，耐溫能力最強。

表3 不同溫度梯度下Y7酵母菌產氣情況

使用Biolog 微生物鑒定儀對篩選菌株進行鑒定，結果顯示，Y2 與Y3，Y19 與Y21 為同種酵母菌。因此，可供三級篩的菌株共計9株，分別為Y3、Y4、Y7、Y10、Y13、Y14、Y17、Y19、Y22。

2.2 耐高溫高產酒精酵母的三級篩分析

2.2.1 高粱汁發(fā)酵過程的失重變化

酵母以糖為底物發(fā)酵產生二氧化碳并溢出，導致發(fā)酵過程發(fā)酵基質的重量逐漸減少直到穩(wěn)定，因此可根據重量的減少程度來判斷發(fā)酵情況。9株菌的發(fā)酵曲線變化如圖3 所示，從總失重量來看，Y3失重量最小僅為7.24 g，Y7 和Y22 失重量較高分別為7.90 g和7.96 g，其余菌株失重量均在7.50 g上下波動。

根據發(fā)酵期長短可分為兩類菌。第一類為短發(fā)酵期菌株Y4、Y7、Y14、Y13、Y17，發(fā)酵時間約8 d，發(fā)酵曲線變化相似，前4 d 發(fā)酵迅速，第5 天進入緩慢發(fā)酵。第二類為長發(fā)酵期菌株Y3、Y10、Y19、Y22，發(fā)酵時間約14 d，其中Y10 適應期較長，第4天進入迅速發(fā)酵，第8天后進入緩慢發(fā)酵；其余3株菌失重情況相似，前11 d 發(fā)酵速度呈較緩直線型，此后進入緩慢發(fā)酵?？傮w而言，前5 株菌較后4 株菌發(fā)酵期短，發(fā)酵速度快，幾乎未出現延滯期，有利于迅速起酵。

2.2.2 耐高溫高產酒精酵母發(fā)酵液理化指標分析

發(fā)酵后期，當發(fā)酵達到平穩(wěn)時（24 h 失重量＜0.1 g），測定發(fā)酵液中還原糖、酒精、總酸及總酯的含量，結果見圖4。圖4 中酒精轉化能力定義為：轉化生成1 度酒精所需要的還原糖量，計算方法為酒精轉化能力=（高粱汁還原糖-發(fā)酵液還原糖）/酒精度，數值越小，表示酒精轉化能力越強。

由圖4 可以看出，Y19 和Y22 總酸低于3 g/L，利于發(fā)酵液酸度控制，且能產生高達1.38 g/L 的總酯，具有較強的產酯能力，但酒精度偏低，酒精轉化能力較弱，發(fā)酵生成1%vol 酒精需還原糖量20 g/L以上。Y13 酒精轉化能力最強，發(fā)酵液酒精度最高（11.65%voL），發(fā)酵生成1 度酒精僅需15.11 g 還原糖，發(fā)酵能力次之的分別是Y7 和Y14，酒精度也均在11%voL 以上，但這3 株菌的產酯能力均較差。Y10 菌株的酒精轉化能力屬于中等水平，但在試驗過程中發(fā)現該菌株能夠分解淀粉，發(fā)揮液化酒醅淀粉的作用。

整體來看，Y19 和Y22 高粱汁發(fā)酵理化指標基本相似，主要具有產酯功能，可二選一繼續(xù)篩選；Y3 菌株酒精轉化能力雖相對弱，但可耐44 ℃高溫；Y10菌株具有解淀粉能力；Y7、Y13、Y14具有較強的產酒能力。因此，可選Y3、Y7、Y10、Y13、Y14及Y22這6株菌進行模擬實驗。

2.2.3 耐高溫高產酒精酵母模擬固態(tài)發(fā)酵分析

將篩選出的6 菌株通過不同組合進行模擬固態(tài)發(fā)酵。發(fā)酵酒醅的初始理化指標見表4。發(fā)酵30 d 后，測定酒醅水分、酸度、還原糖等理化指標（圖5），分析不同菌株組合對酒醅發(fā)酵狀況的影響。

表4 模擬固態(tài)發(fā)酵酒醅初始理化指標

由圖5 可以發(fā)現，不同發(fā)酵組水分在70.5%～72%之間，略高于對照。Z1—Z5 發(fā)酵生酸量少，且均低于對照（2.86 mmol/g），其中Z5 酸度僅為2.02 mmol/g，較對照酸度下降29.4%，具有較強的降酸能力。發(fā)酵結束后Z1—Z5處理殘留淀粉普遍低于對照（6.39 g/100 g），以Z3 最為明顯（4.96 g/100 g），Z4和Z5處中等水平。各處理還原糖含量雖然較對照明顯高，尤其是Z5，較對照增加了2.5 倍，但全部處理總體均比較低，在0.20 g/100 g 以下。說明各發(fā)酵組對酒醅還原糖影響雖不同，但其微生物對酒醅中還原糖的綜合利用均較徹底。從酒精度角度分析來看，Z1—Z5 酒醅酒精含量較對照分別提高26.5%、27.0%、10.1%、31.4%、31.4%，以Z4 和Z5 提高幅度最為明顯，發(fā)酵后酒醅酒精度可達5.85%vol。將消耗淀粉量與酒度做對比來表征各組合發(fā)酵淀粉生成酒精的能力，依次為Z5≈Z4＞Z1≈Z2＞CK＞Z3。因此，從微生物綜合利用淀粉產酒來看，Z5及Z4菌株組合發(fā)酵有較大優(yōu)勢，但考慮到Z5 組合降酸能力相對較強，利于發(fā)酵過程中酒醅酸度的控制，大曲生產時可采用Z5 的菌株組合辦法進行功能菌強化。

2.3 耐高溫高產酒精酵母大曲生產應用分析

大曲是鳳型白酒釀造重要的糖化發(fā)酵劑，通過富集大量的微生物、酶系及代謝產物，為酒醅提供充足的發(fā)酵動力。試驗將篩選出的最優(yōu)菌種組合通過擴大培養(yǎng)與常用的強化菌種按照1∶1 的比例混勻噴灑在曲塊表面，同時以僅噴灑強化菌種的大曲為對照，培曲30 d 后對其性能指標進行檢測、對比分析。單因素方差分析結果顯示SCK（對照曲）與S5（試驗曲）的水分、糖化力、液化力、發(fā)酵力及酯化力在95%的置信水平具有極顯著差異（P＜0.01）（表5）。

大曲四大指標的高低是評價大曲質量的重要依據，此次耐高溫高產酒精酵母的添加主要目標是提高大曲的發(fā)酵力。表5 數據顯示，試驗曲的發(fā)酵力較對照增高0.12 g/0.5g·72 h，提高幅度為14.2%，達到了試驗目的。同時大曲糖化力、液化力及酯化力均有明顯提升，相比對照提高量分別為80.52 mg/g·h、0.10 g/g·h和24.52 mg/50 g·7 d，提高幅度分別為14.9%、13.1%和5.1%。這種現象除與添加菌種的發(fā)酵特性有關外，與添加菌種與成熟曲中多種細菌、霉菌、酵母菌等微生物的相互作用有很大關系[16]。

表5 對照曲與試驗曲理化指標單因素方差分析結果

3 結果與討論

試驗將耐高溫酵母篩選與高產酒精酵母的篩選有機結合，有效縮短了篩選時間，簡化了篩選步驟，提高了篩菌效率。篩選過程中發(fā)現杜氏管產氣與生長曲線對耐溫性能的評價較優(yōu)且比較相似，這與陳宏運等[15]的研究結果一致，但平板點接溫度梯度由于酵母菌在平板表面處于與干熱空氣的半接觸狀態(tài)，加之培養(yǎng)基隨溫度升高出現水分散失、平板皺縮現象，無法較好的表征耐溫性能。

目前有關酵母耐高溫機制的研究多集中于海藻糖，其廣泛分布在各種微生物體內，在出現熱應激時微生物自動調節(jié)海藻糖的積累量以抵御外界不良傷害[17]。大量研究表明海藻糖的含量與酵母的耐受性存在一定的相關性，海藻糖有助于變性蛋白的半折疊狀態(tài)的維持，以便分子伴侶的進一步加工，增加蛋白穩(wěn)定性，并抑制高溫導致的蛋白絮集，提高微生物耐熱性能，但由于溫度太高會導致酵母生理代謝功能衰退，影響海藻糖的合成或降解，耐高溫酵母的耐溫強度與溫度并不成正比關系[18-20]。試驗篩得的2株東方伊薩酵母可耐44 ℃高溫，但劉超帝等[21]從土樣中篩選得到的19 株東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）能夠耐45～47 ℃高溫，產生這種差異的原因主要是同種酵母不同菌株的耐高溫能力也存在明顯差異。

邵明凱等[4]對醬香型白酒酒醅中酵母群落與乙醇產量的研究結果表明，發(fā)酵較好、產乙醇量高的五輪次發(fā)酵酒醅中S.cerevisiae是優(yōu)勢菌，本次試驗高粱汁發(fā)酵結果中產酒精量高的Y10、Y13、Y14 也均為釀酒酵母。同時，篩選得到的Y22 東方伊薩酵母表現出較強的產酯能力，適合與釀酒酵母混合發(fā)酵以提高酒醅中乙醇產量，促進揮發(fā)性香氣物質的積累[22]，這與模擬固態(tài)發(fā)酵酒醅酒精度的提高和大曲應用中發(fā)酵力、酯化力的提高前后表現一致。

從實際生產應用來講，白酒釀造功能微生物研究的關鍵是考察其對基酒發(fā)酵風味物質、功能活性成分、口感等的影響。本研究從大曲中優(yōu)化篩選出6 株耐高溫產酒精酵母，并將其應用到大曲生產當中，明顯提高了大曲各項性能指標，糖化力、液化力、發(fā)酵力、酯化力分別提升了14.9%、13.1%、14.2%和5.1%，具有良好的應用潛能。但這些菌對酒醅發(fā)酵進程及呈香呈味發(fā)酵產物的積累、基酒骨架結構等方面的影響尚不清楚，因此試驗下一步將集中到窖池酒醅發(fā)酵上，系統(tǒng)研究菌種篩選、大曲應用到酒醅發(fā)酵全過程，構建菌種篩選應用的整套試驗方法。