陳 雪，孟勤燕，齊 歡，王 珍，李浩浩，閆宗科

（陜西西鳳酒股份有限公司，陜西鳳翔 721406）

白酒是我國(guó)傳統(tǒng)的釀造食品，是以高粱等淀粉質(zhì)原料為主料，采用大曲作為糖化、發(fā)酵劑，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵和蒸餾而制成的一種飲料酒[1-2]。作為中國(guó)特有的傳統(tǒng)酒種，白酒是中華民族的瑰寶，是世界六大蒸餾酒之一，以其香型多樣、工藝特殊，色澤、香氣、口味、風(fēng)格獨(dú)樹(shù)一幟[3]。白酒除98%的乙醇和水以外，其余2%主要為酸、酯、醇及其他一些微量組分。尤其是酯類(lèi)的含量和比重決定著白酒的香型和品質(zhì)[4]。

乙酸乙酯是我國(guó)白酒中含量較多的香味物質(zhì)之一，尤其是對(duì)清香型、鳳香型和米香型等白酒的風(fēng)格及成型具有重要作用[6]。乙酸乙酯沸點(diǎn)為77 ℃，感官閾值為17.0 mg/L（32 m g/L），具有蘋(píng)果味香氣，刺激帶澀，味短[7]。乙酸乙酯主要由微生物尤其產(chǎn)酯類(lèi)酵母代謝產(chǎn)生。產(chǎn)酯酵母又稱(chēng)生香酵母，主要包括產(chǎn)酯酵母和假絲酵母，是白酒產(chǎn)香的主要菌種之一，產(chǎn)酯酵母主產(chǎn)乙酸酯類(lèi)，特別是乙酸乙酯[9]。產(chǎn)酯酵母能夠以乙醇為碳源，既具備乙醇發(fā)酵能力，又具備醋酸發(fā)酵能力，能以糖、醛、有機(jī)酸、鹽類(lèi)等物質(zhì)為養(yǎng)料，在酯酶作用下合成酯類(lèi)[10]。目前已報(bào)道的高產(chǎn)乙酸乙酯的酵母主要是漢遜酵母[11-12]、假絲酵母、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、異常畢赤酵母（Picha anomala）[12-13]、平常假絲酵母（Candida inconspicua）[10]等酵母種屬。

如何提高白酒中酯類(lèi)的含量是白酒生產(chǎn)者普遍關(guān)注的問(wèn)題。20 世紀(jì)70 年代以來(lái)，我國(guó)許多酒廠采用純種培養(yǎng)產(chǎn)酯酵母，應(yīng)用于白酒生產(chǎn)，顯著改善及提高了酒質(zhì)，產(chǎn)酯酵母的功能因此受到人們的重視。鳳香型白酒其主要香氣是以乙酸乙酯為主，己酸乙酯和高級(jí)醇為輔的復(fù)合香氣。因此，篩選適合鳳香型白酒釀造的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)乙酸乙酯功能菌株，對(duì)鳳香型白酒優(yōu)質(zhì)高效釀造具有實(shí)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 菌株、試劑

菌種：企業(yè)技術(shù)中心保藏的酵母菌株22 株、酒醅中分離的酵母菌株78株。

試劑及耗材：酵母浸粉、葡萄糖、蛋白胨、麥芽浸粉、鹽酸、氯化鈉、硫酸、無(wú)水乙醇。

1.1.2 培養(yǎng)基

麥芽汁培養(yǎng)基：12°Bx 麥芽汁，分裝，115 ℃滅菌20 min。

YPD 液體培養(yǎng)基：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水定容至1000 mL，以115 ℃滅菌30 min。

PDA 液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水定容至1000 mL，115 ℃滅菌30 min。

TTC 下層培養(yǎng)基：葡萄糖10.1 g，蛋白胨2.0 g，酵母浸粉1.5 g，瓊脂30 g，酸性磷酸鉀1.0 g，硫酸鎂0.4 g，檸檬酸0.27 g，水200 mL。

TTC 上層培養(yǎng)基：TTC 0.5 g，葡萄糖0.5 g，瓊脂1.5 g，水100 mL。配制5%TTC 溶液（避光下用溫水溶解，經(jīng)0.22 μm 醋酸纖維膜過(guò)濾后，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫┐囵B(yǎng)基溫度降到50 ℃，添加1 mL 到100 mL培養(yǎng)基中。

高粱汁：取高粱粉1 份，加入4 份自來(lái)水煮1～2 h，按使用說(shuō)明加入淀粉酶液化，液化后補(bǔ)加60 ℃溫水1 份，加入原料量的5%糖化酶（5 萬(wàn)活力單位），攪拌均勻，以60 ℃糖化3～4 h，用稀碘液試之不顯藍(lán)色，再加熱至90 ℃。用細(xì)紗布過(guò)濾后加熱濃縮。調(diào)整糖度至12°Bx，20%硫酸調(diào)至pH4.5，分裝至三角瓶中，115 ℃，滅菌20 min。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：粉碎后高粱300 g，加90 ℃水270 mL，90 ℃潤(rùn)糧5 h，100 ℃滅菌120 min。取出攤晾，加入45 g 清蒸稻殼，添加1%乙酸，無(wú)菌水調(diào)整水分在63%～65%。

1.1.3 儀器設(shè)備

生化培養(yǎng)箱、恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)式搖床、冷凍高速離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、顯微鏡、微生物鑒定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酵母菌株的分離純化

取高產(chǎn)乙酸乙酯班組的酒醅，稱(chēng)取10 g 酒醅于含90 mL 無(wú)菌生理鹽水的三角瓶中，200 r/ min 振蕩浸提30 min，吸取上清液，稀釋到合適濃度，選3個(gè)濃度梯度，取200 μL 涂布于孟加拉紅平板。30 ℃培養(yǎng)3 d 后，挑取生長(zhǎng)良好的酵母單菌落進(jìn)一步劃線分離2～3 次，經(jīng)鏡檢為純種后分別轉(zhuǎn)入YPD固體斜面，培養(yǎng)好后4 ℃冰箱保藏[14]。

1.2.2 高產(chǎn)乙酸乙酯酵母的篩選

初篩：菌株經(jīng)活化接入12°Bx麥芽汁液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)7 d，每株菌做2 個(gè)平行，進(jìn)行風(fēng)味嗅聞評(píng)定，記錄各菌株酯香味（香蕉、蘋(píng)果等香味）的強(qiáng)弱。同時(shí)以不接菌的平板和液體培養(yǎng)基為空白，篩選出酯香濃郁、香氣獨(dú)特的酵母菌。

復(fù)篩：復(fù)篩酵母菌在液體YPD 中活化，30 ℃，100 r/min，16～24 h。以相同接種量（1×107cfu/mL）分別接入裝有120 mL 12 °Bx 高粱汁的三角瓶中，安裝發(fā)酵栓并稱(chēng)重，置于30 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，每隔24 h 稱(chēng)重，記錄失重量，當(dāng)失重量小于0.2 g 時(shí)停止培養(yǎng)，每個(gè)菌做2 個(gè)平行。發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)理化指標(biāo)和乙酸乙酯含量。

乙酸乙酯的測(cè)定：取100 mL 發(fā)酵液至500 mL圓底燒瓶中，加入100 mL 60%乙醇進(jìn)行蒸餾，收集100 mL 餾分[11]，皂化法測(cè)定總酯，同時(shí)以40%vol無(wú)酯酒精做空白。總酯高的樣品，繼而用氣相色譜測(cè)定乙酸乙酯的含量。

1.2.3 高產(chǎn)乙酸乙酯酵母耐受性的測(cè)定

酒精耐受性：在試管中添加YPD 液體培養(yǎng)基5 mL 并加入杜氏管，滅菌之后分別加入無(wú)水乙醇調(diào)整初始酒精濃度為8%vol、10%vol、12%vol、14%vol，將活化好的菌株按接種量為106cfu/mL接入，設(shè)置3個(gè)平行，30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)，每隔12 h觀察產(chǎn)氣，觀察10 d。

同理測(cè)定溫度（32 ℃、35 ℃、38 ℃、40 ℃）耐受性，酸度(初始pH 值為2.5、3.0、3.5、4.0)耐受性，恒溫靜置培養(yǎng)，每隔4 h 觀察產(chǎn)氣，3 d 后在600 nm 條件下測(cè)定吸光度。

1.2.4 優(yōu)選菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化

正交實(shí)驗(yàn)：考察發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、pH 值、酒精度4個(gè)因素對(duì)其產(chǎn)乙酸乙酯量的影響[16]，按L16(45)進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

通過(guò)正交試驗(yàn)獲得酵母菌株產(chǎn)酯的最佳工藝條件，進(jìn)行3次在該優(yōu)化產(chǎn)酯條件下的驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.2.5 固態(tài)發(fā)酵小試

模擬鳳香型白酒生產(chǎn)工藝，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基攤晾至溫度30 ℃左右添加20%大曲，MY0-3 酵母菌接入量為1×107cfu/g，拌勻后每3000 g 分裝入5 L玻璃罐中，蓋上塞子，纏上保鮮膜，置于恒溫培養(yǎng)箱中，30 ℃培養(yǎng)。20 d 發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定乙酸乙酯和基本理化指標(biāo)（水分、酸度、還原糖、酒精度）。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌株的分離

在酒醅中共分離出78 株酵母菌株，在平板上進(jìn)行聞香及TTC 顯色試驗(yàn)。篩選出具有濃郁香氣的菌株為1-5、7、10、13、16、17、73-75、25、26、28、32、33、41、43、57、59、69-72，共計(jì)26 株，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 分離菌株的平板篩選

2.2 高產(chǎn)乙酸乙酯菌株的篩選

初篩：對(duì)26 株篩選的酵母菌株進(jìn)行活化，以106cfu/mL 濃度接入50 mL、12°Bx 麥芽汁，30 ℃培養(yǎng)7 d 后進(jìn)行聞香。篩選出7、10、13、17、25、43、59、57、71、72、74，共計(jì)11 株菌株，具有中等至濃郁的香氣。通過(guò)微生物鑒定儀進(jìn)行菌株鑒定，鑒定出6株，結(jié)果見(jiàn)表3。

液體發(fā)酵復(fù)篩：將產(chǎn)酯的強(qiáng)化菌株4 株、現(xiàn)存相關(guān)酵母菌株20 株以及酒醅中篩選的酵母6 株，共計(jì)30 株。統(tǒng)一進(jìn)行12 °Bx 高粱汁液體發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)總酯及基本理化指標(biāo)，選總酯較高的樣品測(cè)定乙酸乙酯含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。產(chǎn)乙酸乙酯含量最高的菌株是MY0-3，乙酸乙酯產(chǎn)量達(dá)到3.73 g/L；其次具有高產(chǎn)乙酸乙酯潛力的菌株為MY5-9、B003、C3、B005、Y1、P6、74，乙酸乙酯產(chǎn)量分別為0.63 g/L、0.46 g/L、0.35 g/L、0.33 g/L、0.23 g/L、0.33 g/L、0.16 g/L。其中MY0-3 具有高產(chǎn)乙酸乙酯、低產(chǎn)乙醇、增酸及發(fā)酵較徹底的特點(diǎn)；C3 具有低產(chǎn)乙醇、發(fā)酵較徹底、產(chǎn)酸最少等特性；Y1、B003、B005、74具有高產(chǎn)酒精特性。

表3 聞香優(yōu)選菌株

表4 液體發(fā)酵復(fù)篩結(jié)果

2.3 優(yōu)選菌株耐受性（圖1、圖2，表5—表7）

結(jié)果顯示，MY0-3、B003、B005 具有較低的酒精耐受性，最高耐受8%vol；C3、MY5-9、Y1最高耐受10%vol 的酒精，P6、74 酒精耐受性最高，可耐12%vol～14%vol 的酒精。菌株MY0-3 和MY5-9最高耐受3.0 的酸度，其他均可耐受2.5 的酸度。MY0-3 和B005 最高耐受35 ℃，B003 最高耐受溫度為38 ℃，C3、Y1、P6、74、MY5-9 均可耐受41 ℃的溫度。綜合以上，菌株MY0-3 具有較低的酒精耐受性和溫度耐受性，P6、74 具有較高酒精耐受性和溫度耐受性。

表5 優(yōu)選菌株的酒精耐受性(產(chǎn)氣)

表6 優(yōu)選菌株的溫度耐受性(產(chǎn)氣)

2.4 產(chǎn)酯條件優(yōu)化

L16(45)正交試驗(yàn)進(jìn)行產(chǎn)酯發(fā)酵條件優(yōu)化，以乙酸乙酯的產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、pH值、酒精度4個(gè)因素，研究其對(duì)高產(chǎn)乙酸乙酯MY0-3 菌株產(chǎn)酯的影響，確定最佳的產(chǎn)酯工藝條件，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表8，方差分析結(jié)果見(jiàn)表9。

由表9可知，各影響因素對(duì)酵母MY0-3產(chǎn)酯的影響程度為RC＞RD＞RA＞RB，即發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞pH 值＞酒精度。綜合分析得到產(chǎn)酯最佳方案為A2B2C1D4，即發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵時(shí)間9 d，pH3.5，酒精度2%vol。在該優(yōu)化產(chǎn)酯條件下，通過(guò)3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到酵母菌株MY0-3 產(chǎn)乙酸乙酯的量為6.2 g/L。

2.5 固態(tài)發(fā)酵小試實(shí)驗(yàn)

表8 產(chǎn)酯條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

表9 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

制作MY0-3 麩曲應(yīng)用于高粱固態(tài)發(fā)酵小試，對(duì)照組為鳳型大曲，實(shí)驗(yàn)組為鳳型大曲+MY0-3 麩曲，固態(tài)發(fā)酵小試的基本理化指標(biāo)見(jiàn)表10。發(fā)酵20 d 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組的乙酸乙酯含量高19.5%，發(fā)酵27 d 比對(duì)照組高17.8%。實(shí)驗(yàn)組的乙酸乙酯含量隨發(fā)酵周期的延長(zhǎng)而呈增加趨勢(shì)，酒精度在發(fā)酵后期略有下降。

表10 MY0-3固態(tài)發(fā)酵小試基本理化指標(biāo)

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)存酵母菌株及酒醅中分離酵母的篩選，共獲得具有高產(chǎn)乙酸乙酯特性的酵母菌株8 株，依次排序分別是MY0-3、MY5-9、B003、C3、B005、Y1、P6 和74。測(cè)定優(yōu)選菌株的酒精、酸度及高糖耐受性，MY0-3 具有較低的酒精耐受性，最高耐受8%vol，最高耐受35 ℃；最高耐受3.0 酸度。通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化MY0-3 的產(chǎn)酯發(fā)酵條件，優(yōu)化的發(fā)酵條件為pH3.5，酒精度2%vol，溫度25 ℃，發(fā)酵時(shí)間9 d，乙酸乙酯的產(chǎn)量為6.2 g/L。應(yīng)用MY0-3 的固態(tài)發(fā)酵小試中，發(fā)酵20 d，乙酸乙酯含量實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組高19.5%。