張溫清，司冠儒，李井雷，周慧佳，張逮文，段亮亮，葉 明，姚中春，張 琦，周 萍

（1.合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院，安徽合肥 230009；2.安徽宣酒集團股份有限公司科研技術(shù)中心，安徽宣城 242000；3.江南小窖釀造工藝研究所，安徽宣城 242000；4.安徽農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，安徽合肥 230036）

芝麻香型白酒是中國白酒十二大香型之一，因其幽雅細膩的焦糊香氣、醇厚豐滿的獨特風格備受人們喜愛[1-5]。高氮配料是芝麻香型白酒生產(chǎn)工藝的特點之一，對形成芝麻香型白酒的典型風格具有重要作用[6]。含氮類雜環(huán)化合物和含硫化合物是芝麻香型白酒中重要的風味化合物，二者的產(chǎn)生都與釀酒原料中的蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)[7]。原料中的蛋白質(zhì)經(jīng)微生物代謝產(chǎn)生氨態(tài)氮，而氨態(tài)氮是釀酒微生物生長、繁殖、代謝產(chǎn)生芝麻香型白酒風味物質(zhì)所需的直接氮源。本研究在窖泥中氨態(tài)氮檢測方法的基礎(chǔ)上，針對糟醅樣品特點，對前處理方法進行優(yōu)化，開發(fā)適合芝麻香型白酒糟醅中氨態(tài)氮的測定方法，以便于日常監(jiān)控酒糟中的氨態(tài)氮，合理調(diào)整配料比，對芝麻香白酒的生產(chǎn)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：待測定的酒糟均由安徽宣酒集團股份有限公司提供。

儀器設(shè)備：分光光度計722 型，上海菁華儀器；臺式離心機TG16-WS，湖南湘儀；電子天平ME204E，上海梅特勒-托利多儀器。

試劑：碘化汞、碘化鉀、氫氧化鈉，酒石酸鉀鈉，氯化銨均為分析純，購于國藥試劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制

奈氏試劑：稱取碘化汞10 g、碘化鉀7 g，加到50 mL 360 g/L NaOH 溶液中,溶解搖勻后,加水定容至l00 mL，貯存于棕色具膠塞瓶中，靜置，取上層清液使用。

酒石酸鉀鈉溶液：取50 g酒石酸鉀鈉溶于l00 mL水中，煮沸，蒸發(fā)約1/3體積以去除酒石酸鉀鈉中可能存在的銨鹽，冷卻后，加水定容至l00 mL。

氯化銨標準儲備液：準確稱取0.3819 g NH4Cl，用水溶解并定容至100 mL。濃度以N計為1 mg/mL。

氯化銨標準使用液：吸取氯化銨標準儲備液10 mL，用水稀釋并定容至1 L。濃度以N計為10 μg/mL，以NH3計為12.2 μg/mL。

1.2.2 樣品的前處理

稱取2 g 酒糟加入到20 mL 100 g/L 氯化鈉溶液中，混勻，8000 r/min 離心15 min，取2 mL 上清液0.45 μm 水相膜過濾。取0.1 mL 濾液于比色管中，補水至10 mL，加入2 滴酒石酸鉀鈉溶液，然后加入1 mL 奈氏試劑，混勻。放置10 min，425 nm 處測定吸光值。

1.2.3 標準曲線繪制

分別吸取氯化銨標準使用液0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL 于10 mL 比色管中，用水稀釋至刻度，加入2滴酒石酸鉀鈉溶液，然后加入1 mL 奈氏試劑，混勻。放置10 min，425 nm 處測定吸光值。以吸光度對氨態(tài)氮（N）微克數(shù)繪制標準曲線。

1.2.4 結(jié)果計算

氨態(tài)氮（絕干計，g/kg）=C/[10(1-w)]

式中：C——根據(jù)標準曲線求得的試樣溶液中氨態(tài)氮質(zhì)量，μg；w——新鮮糟醅水分，%。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理優(yōu)化

土質(zhì)樣品中氨態(tài)氮的測定方法已被廣泛應(yīng)用于窖泥中氨態(tài)氮的測定。氯化鈉溶液浸出窖泥中的氨態(tài)氮，與奈氏試劑反應(yīng)生成淡黃色至紅棕色絡(luò)合物，425 nm 處測定吸光度，與標準氨溶液比較，計算樣品氨態(tài)氮含量。此法測得的氨態(tài)氮是游離氨（NH3）和銨鹽（NH4+）的總量。根據(jù)酒糟的性質(zhì)，本研究對樣品的前處理進行了優(yōu)化：減少了稱樣重量，由5 g 減少至2 g；并將反應(yīng)體系的溶液體積由25 mL 減至10 mL，避免了試劑的浪費；將濾紙過濾改為高速離心+針筒式快速過濾，實現(xiàn)了大批量樣品的前處理，縮短了70%的分析時間，提高了工作效率，而且確保后期吸光值的準確測定；調(diào)整了酒石酸鉀鈉和奈氏試劑的相對用量，使反應(yīng)更加充分。

2.2 標準曲線與方法精密度和精確性

按照實驗步驟所述，以425 nm 處吸光值為橫坐標，氨態(tài)氮（N）微克數(shù)為縱坐標，繪制標準曲線，如圖1 所示。在酒糟樣品中添加不同濃度的氯化銨，計算回收率，并通過重復性實驗（n=3）檢驗該方法的相對標準偏差。由表1 可知，該方法檢測酒糟中氨態(tài)氮的回收率在101.31%～104.45%之間，相對標準偏差在2.81%～3.85%之間，可見該方法對于氨態(tài)氮的檢測具有較高的準確性和精確性，能夠滿足酒糟中氨態(tài)氮的分析檢測要求。此外，本實驗還進行了樣品過濾前后相同氯化銨濃度的添加實驗，結(jié)果顯示，過濾步驟不會對糟醅中氨態(tài)氮的測定產(chǎn)生影響。

2.3 芝麻香型白酒酒糟中氨態(tài)氮的檢測

表1 酒糟中氨態(tài)氮回收率的測定(n=3)

利用以上確立的前處理方法，對芝麻香型白酒和濃香型白酒糟醅蒸餾前后樣品中的氨態(tài)氮進行測定，所測得數(shù)據(jù)如表2 所示。與濃香型白酒相比，芝麻香型白酒生產(chǎn)工藝采用高氮配料，其酒糟中的氨態(tài)氮也較高。經(jīng)過蒸餾，出窖酒糟中的氨態(tài)氮含量減少。這可能因為是一部分氨態(tài)氮隨著酒糟高溫蒸餾而揮發(fā)，另一部分離子形態(tài)的氨態(tài)氮與糟醅中的其他物質(zhì)發(fā)生了化學反應(yīng)，如蒸餾工藝階段芝麻香型糟醅中的NH4+與乙偶姻發(fā)生反應(yīng)生成重要的風味化合物四甲基吡嗪[1]。因此，該方法也可以用于四甲基吡嗪前體的檢測，對深入研究芝麻香型白酒四甲基吡嗪生成機理具有重要意義。

表2 白酒酒糟中氨態(tài)氮的測定

3 結(jié)論

本研究建立了測定白酒酒糟中氨態(tài)氮的方法，并對芝麻香型白酒酒糟和濃香型白酒蒸餾前后酒糟中氨態(tài)氮的含量進行了測定，結(jié)果顯示，芝麻香型白酒酒糟中氨態(tài)氮的含量較高，經(jīng)過蒸餾環(huán)節(jié)，酒糟中的氨態(tài)氮含量降低。該方法測定酒糟中氨態(tài)氮的相對標準偏差（RSD）為2.81%～3.85%，回收率為101.31%～104.45%。所建立方法的準確性、重復性及精度均較高，可用于芝麻香型白酒酒糟的日常檢測分析，也為監(jiān)控酒糟中蛋白質(zhì)的利用狀態(tài)，優(yōu)化配料工藝提供參考依據(jù)。