姚 燦，張 倩，3， 張 霞，3，，楊 濤，李國友，王愛軍，武志強

（1.中國科學院成都生物研究所，四川成都 610041；2.河北古順釀酒股份有限公司，河北邢臺 054000；3.中國科學院大學，北京 100049）

我國白酒釀造歷史悠久，蒸餾酒的生產可追溯到西漢時期[1]。神曲酒是我國的歷史名酒，唐代邢州神曲酒更是十分有名。北魏賈思勰的《齊民要術》中記載了一種“神曲”，其特色在于藥曲，即在酒曲制作過程中加入野蓼、桑葉、荷葉等中藥材。據《齊民要術》記載，“神曲”相較普通曲而言，具有發(fā)酵力強、發(fā)酵周期稍短的特點，即藥材中的活性成分會影響大曲微生物生態(tài)，使得大曲中的功能微生物發(fā)生變化。此外，藥材中的香味物質也可能會轉移到酒體中，形成具有獨特風味并含有健康功能因子的白酒。

大曲，素有“酒之骨”之稱，蘊含豐富的微生物資源和酶系，是白酒釀造的驅動力，具有糖化、發(fā)酵、生香、呈味的作用[2]。近年來，研究人員利用高通量測序技術針對白酒大曲樣品進行了一系列微生物群落結構的研究，發(fā)現微生物的群落結構分布與大曲品質密切相關[3]。夏玙等[4]結合實時熒光定量聚合酶鏈式反應和二代測序技術，研究了熱風干燥工藝對貯存期大曲中真菌群落的影響。趙金松等[5]采用非可培養(yǎng)技術結合多元統計方法對大曲中的微生物群落和風味物質進行了相關性分析。徐占成等[6]運用宏基因組學技術對劍南春大曲真菌群落組成進行了深入研究。

為研究“神曲”與普通中高溫大曲之間微生物群落組成的差異，本試驗以河北古順釀酒股份有限公司生產的普通中高溫大曲、“神曲”普通曲和“神曲”荷葉曲為研究對象，利用高通量測序技術對3類古順大曲進行深入分析，為“神曲”運用于白酒生產提供一定理論支撐和技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料

普通中高溫大曲、“神曲”普通曲（加入野蓼、桑葉2 種中藥材）和“神曲”荷葉曲（加入野蓼、桑葉、荷葉3 種中藥材）（皆由河北古順釀酒股份有限公司提供），DNA 提取試劑盒（ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit 1.3.0）和其他分子實驗材料（由成都羅寧生物科技有限公司提供）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣本DNA提取

采用ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit 1.3.0對樣本的基因組DNA 進行抽提后，利用瓊脂糖凝膠電泳對DNA純度進行檢測，保存于-20 ℃冰箱。

1.2.2 PCR擴增

按指定測序區(qū)域，合成帶有Barcode 的特異引物分別對樣本的16S rDNA V4 區(qū)和ITS 2 區(qū)域進行擴增。

引物序列如下：

515F(5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3')；

806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')；

ITS3 KYO2(5'-GATGAAGAACGYAGYRAA-3')；

ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')；

PCR反應體系見參考文獻[7]。

1.2.3 PCR產物定量

將樣本的PCR 產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用膠回收試劑盒切膠回收PCR 產物，TE 緩沖液洗脫回收目標DNA 片段。參照電泳檢測結果，將PCR 回收產物用Qubit 2.0（ThermoFisher 公司）進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。

1.2.4 文庫構建與測序

使用試劑盒TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit 進行文庫構建；采用PE250 測序方式，使用Hiseq Rapid SBS Kit v2 作為測序試劑盒、上機測序。

1.3 數據分析

原始數據經過拼接、過濾得到可供后續(xù)分析的高質量目標序列。在97%相似性水平上進行OTU（Operational Taxonomic Units）聚類并挑選出OTU的代表性序列，使用SILVA 數據庫確定物種分類信息，獲得細菌或真菌從門到屬水平下的種類及相對豐度。

2 結果與分析

2.1 細菌群落組成分析

2.1.1 細菌門水平群落組成圖（圖1）

圖1 表明，在3 類大曲（普通曲（PT）、“神曲”普通曲（SP）、“神曲”荷葉曲（SH））中，厚壁菌門（Firmicutes）與放線菌門（Actinobacteria）相對豐度總和均超過98.5%，細菌中厚壁菌門占絕對優(yōu)勢，相對豐度皆超過97.1%。表明3 類大曲的細菌群落結構在門水平上相似。

2.1.2 細菌屬水平群落組成圖（圖2）

從屬水平分類上，不同大曲中微生物的種類分析結果見圖2。3 類大曲中，魏斯氏菌屬（Weissella）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和片球菌屬（Pediococcus）3 類微生物的相對豐度總和達到89.8%。魏斯氏菌屬和乳桿菌屬是3 類大曲中的優(yōu)勢物種，二者相對豐度總和超過83.4%。說明3 類古順大曲中的細菌皆以乳酸菌為主要微生物。除上述3類微生物之外，腸球菌屬（Enterococcus）、毛螺菌屬（Lachnospiraceae）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、鏈球菌屬（Streptococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、腎桿菌屬（Renibacterium）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）等相對豐度較低的微生物在3類大曲中也被檢測到。

2.2 真菌群落組成分析

2.2.1 真菌門水平群落組成圖（圖3）

基于真菌ITS 基因聚類分析，3 類大曲在門水平上的結果見圖3。結果表明，子囊菌門（Ascomycota）與毛霉亞門（Mucoromycota）2類微生物是3類大曲中的優(yōu)勢微生物，二者相對豐度總和超過99.3%，其中子囊菌門占絕對優(yōu)勢，其相對豐度高達94.4%，在SH 中達到了96.3%；毛霉亞門的相對豐度則介于3.0%～4.9%之間。

2.2.2 真菌屬水平群落組成圖（圖4）

在屬水平上，3 類大曲的主要微生物結構分布如圖4 所示。結果表明，熱子囊菌屬（Thermoascus）和曲霉屬（Aspergillus）是PT、SP 和SH 中的優(yōu)勢真菌，其相對豐度總和分別占比93.3%、84.9%、56.4%；在3類大曲樣品中，熱子囊菌屬的相對豐度范圍為30.8%～74.2%，SP 與SH 接近（30.8%、33.7%），最大值出現于PT樣品（74.2%）；曲霉屬的相對豐度范圍為19.1%～54.1%，PT 與SH 相接近（19.1%、22.7%），最大值出現在SP 樣品（54.1%）。根毛霉菌屬（Rhizomucor）在所有樣品中的相對豐度差異較?。ū３衷?.5%左右）。根據方差分析（ANOVA）結果，嗜熱真菌屬（Thermomyces）在3 類大曲中有顯著差異（p＜0.05），其在SH 樣品的相對豐度達到36.7%，而在PT 樣品中僅為0.3%，說明嗜熱真菌屬是SH樣品中的主要真菌群類。

3 結論

大曲是白酒釀造的糖化發(fā)酵菌劑，是決定白酒出酒率及口感風味的關鍵所在，而大曲微生物又是決定大曲品質的核心因素之一[8-9]。本研究利用高通量測序技術對古順3 類大曲的微生物群落結構進行了深入分析。結果表明，3 類大曲中的細菌主要為厚壁菌門，并以乳酸菌群為優(yōu)勢菌，“神曲”中的原核微生物的物種多樣性及相對豐度與普通曲無顯著差異；真菌則以子囊菌門為主，其中熱子囊菌屬和曲霉屬是3 類大曲中共有的優(yōu)勢真菌，方差分析結果表明，嗜熱真菌屬在“神曲荷葉曲”中是主要真菌群類。譚崇堯等[10]對不同地域濃香型大曲微生物的分析結果中表明，長江中游和江淮地區(qū)的大曲中真菌主要為曲霉屬，北方派有酵母和嗜熱高溫菌（熱子囊菌屬和嗜熱真菌屬）為主要優(yōu)勢菌的差異。由此可見，在真菌群落結構方面，古順普通曲與以嗜熱高溫菌為優(yōu)勢菌的北方派相似；“神曲普通曲”則接近于以曲霉屬為主的長江中游和江淮地區(qū)；而“神曲荷葉曲”（以熱子囊菌屬、曲霉屬和嗜熱真菌屬為主要真菌群類）則更接近于以嗜熱高溫菌為主要優(yōu)勢菌的北方派。