柒葉荷 黃全奎 周松峰 白云華 賴平生 秦樹英 吳健敏*

（1.廣西里建桂寧種豬有限公司，廣西 南寧，530105；2.北京百凈?？萍及l(fā)展有限公司，北京，100093；3.南寧正大畜牧有限公司，廣西 南寧，530219；4.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西 南寧，530001）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種在全球范圍內(nèi)廣泛傳播的豬的重要病毒性傳染病，又稱豬藍(lán)耳病。其臨床癥狀主要表現(xiàn)為懷孕母豬早產(chǎn)、流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎等，仔豬和育肥豬會出現(xiàn)呼吸道癥狀，并伴隨有間歇性肺炎，病死率較高，是世界范圍內(nèi)造成嚴(yán)重的豬繁殖與呼吸系統(tǒng)疾病的主要病因［1］。PRRSV主要在豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）和樹突狀細(xì)胞（DC）中復(fù)制，該病目前無有效治療藥物，死亡率較高，嚴(yán)重影響全球養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失［2,3］。

疫苗一直是人們預(yù)防和控制PPRS的首選和重要工具，但在當(dāng)前非洲豬瘟風(fēng)險(xiǎn)增加和養(yǎng)豬形勢嚴(yán)峻的情況下，殺毒劑的使用越來越受到人們的關(guān)注。金百麥環(huán)境改良劑（Genbiom）是一種全新的固態(tài)環(huán)境改良劑，主要成分為二氧化鈦［4］。它不僅可以降解環(huán)境中的污染物，還能夠起到殺滅病毒和細(xì)菌的作用［5］。本試驗(yàn)旨在通過Genbiom對PRRSV殺滅效果的體外試驗(yàn)來驗(yàn)證Genbiom的殺毒能力，以期為PPRS感染的預(yù)防和控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

PRRSV（分離株，1×104.25TCDI50）為高致病性藍(lán)耳變異株由金百麥生物科技有限公司提供，Marc-145細(xì)胞由哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司提供，Genbiom干粉由金百麥生物科技有限公司提供，MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基，胰酶購自GIBCO公司，新生牛血清購自山西潤生大業(yè)生物材料有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Marc-145細(xì)胞準(zhǔn)備將Marc-145細(xì)胞以0.5-2×104/孔鋪到96孔板內(nèi)，培養(yǎng)約12h，即長滿板底約70%時(shí)，將10% FBS DMEM培養(yǎng)基換成含2%FBS和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，用于抗病毒效果評價(jià)。

1.2.2 Genbiom最大無毒用量摸索分別無菌稱取25mg、50mg、100mg、200mg和400mg已高壓滅菌處理的Genbiom于1.5mL離心管中，然后分別加入500μL細(xì)胞培養(yǎng)液，震蕩混勻，加入1.2.1中準(zhǔn)備的Marc-145細(xì)胞的細(xì)胞板，培養(yǎng)72h，觀察細(xì)胞病變情況（CPE），無細(xì)胞病變的最高量為該產(chǎn)品的最大無毒量。

1.2.3 Genbiom最低有效量測定分別無菌稱取25mg、50mg、100mg、200mg和400mg已高壓滅菌處理的Genbiom于1.5mL離心管中，然后分別加入100μL PRRSV病毒液（1×104.25TCDI50），震蕩混勻，室溫下充分作用30min后，加入500μLDMEM培養(yǎng)基，反復(fù)震蕩混勻，靜置5min后，5000rpm，4℃離心5min，取30μL上清接種96孔長滿Marc-145單層細(xì)胞板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72h，觀察細(xì)胞產(chǎn)生CPE情況，同時(shí)分別設(shè)病毒陽性和無病毒的空白對照組，不產(chǎn)生CPE的藥物最小使用量為該產(chǎn)品的最低有效量。

1.2.4 Genbiom最短作用時(shí)間測定無菌稱取Genbiom干粉按1.2.2方法測定最低有效量200mg，與PRRSV病毒液（1×104.25TCDI50）進(jìn)行作用，室溫下分別靜置5 min、10min、30min、60min，使Genbiom干粉與100μL病毒液充分作用。作用完后，加入500μLDMEM培養(yǎng)基，反復(fù)震蕩混勻，靜置5min后，5000rpm，4℃離心5min，取上清，分別將上清接種長滿Marc-145細(xì)胞單層的96孔細(xì)胞板，同時(shí)設(shè)陰、陽性對照。將接種后的96孔細(xì)胞板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72h，記錄細(xì)胞發(fā)生CPE的情況。

3 結(jié)果與分析

3.1 Genbiom最大無毒用量摸索

不同用量的Genbiom對Marc-145細(xì)胞的毒性作用分析如圖1所示。從圖1細(xì)胞生長狀況來看，本研究所選用的5種不同劑量的Genbiom，與陰性對照組相比，Marc-145細(xì)胞狀態(tài)均生長正常，無明顯的細(xì)胞死亡、圓縮及生長狀態(tài)不佳情況出現(xiàn)，表明至少用量至400mg的Genbiom對細(xì)胞無毒性作用。

3.2 Genbiom最低有效量測定

Genbiom最低有效量檢測結(jié)果如圖2所示。使用25mg Genbiom用量組與病毒作用后，加入Marc-145細(xì)胞，培養(yǎng)72h后在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞大量死亡，出現(xiàn)PRRSV的典型病變；50mg用量組，細(xì)胞變圓縮、生長狀態(tài)不佳；100mg用量組，細(xì)胞出現(xiàn)少量的圓縮；當(dāng)200mg和400mg Genbiom與病毒相互作用30min后細(xì)胞狀態(tài)均生長正常，無明顯的細(xì)胞死亡、圓縮及生長狀態(tài)不佳情況出現(xiàn)，未見到細(xì)胞病變；陰性對照組細(xì)胞生長正常，而陽性對照細(xì)胞大量死亡，陰陽性對照均成立。根據(jù)以上結(jié)果可以得出，Genbiom最低有效量為200mg。

圖1 不同用量的Genbiom對Marc-145細(xì)胞的毒性作用分析

圖2 Genbiom最低有效量測定

圖3 Genbiom最短作用時(shí)間測定結(jié)果

3.3 最短作用時(shí)間測定結(jié)果

Genbiom殺滅PRRSV最短作用時(shí)間結(jié)果如圖3所示。200mg Genbiom與病毒作用15min，加入Marc-145細(xì)胞，培養(yǎng)72h，在倒置顯微鏡下觀察，40%細(xì)胞出現(xiàn)了死亡、圓縮病變，而Genbiom作用30min、45min和60min，細(xì)胞與陰性對照相比，均無細(xì)胞病變。本試驗(yàn)的陰陽性對照組均成立，最終確定Genbiom殺滅PRRSV最短作用時(shí)間為30min。

4 討論與結(jié)論

獸用消毒劑很多是復(fù)方消毒劑，研究人員已經(jīng)對消毒類產(chǎn)品做過很多研究，對多種病毒、細(xì)菌及芽孢菌等殺滅效果也做了大量的對比試驗(yàn)，但目前多數(shù)消毒劑為液體消毒，在豬舍內(nèi)使用容易導(dǎo)致潮濕，尤其在非洲豬瘟影響下的養(yǎng)豬場來說，增加了病毒傳播的風(fēng)險(xiǎn)，急需一種可以干粉殺毒，無害無毒，綠色環(huán)保的新型消毒劑。

金百麥環(huán)境改良劑（Genbiom）采用國際先進(jìn)的納米光催化技術(shù)，利用二氧化鈦（TiO2）半導(dǎo)體的效應(yīng)，材料表面吸收氧和水分，產(chǎn)生降解環(huán)境污染物和抑菌殺菌的作用。例如，Genbiom具有良好的降氨能力［6］，能夠維持良好的養(yǎng)殖環(huán)境。TiO2在催化過程中具有較強(qiáng)的抑菌作用，可做與食品直接接觸的包裝材料和食品添加劑［7］。納米二氧化硅因?yàn)槠淞己玫目咕芰Γ呀?jīng)作為醫(yī)療植入物在臨床中得到應(yīng)用［8］。

此研究建立了以PRRSV為指示病毒的Genbiom體外殺毒的評價(jià)模型，重點(diǎn)評估了Genbiom最低有效量和最短作用時(shí)間，以期為PRRS的環(huán)境殺滅評估提供一種可行和敏感的方法?？蛇m用于豬場環(huán)境及人員、水體消毒和家庭日常消毒等，是一種安全高效環(huán)保的環(huán)境改良劑。

本研究對Genbiom干粉對PRRSV殺滅效果進(jìn)行了初步探究，雖然病毒在不同細(xì)胞株傳代易感性不同［9］，結(jié)果可能會有略微差別，但是本次試驗(yàn)結(jié)果表明，Genbiom對PRRSV具有良好的殺滅效果，最低有效量為200mg，最短作用時(shí)間為30 min，同時(shí)根據(jù)Genbiom良好的殺毒滅菌能力，可用于豬場消毒及環(huán)境改良。