劉 珊，魏蕊霞，于曉惠，從 幸，劉榮娜，楊 波

盡管體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET)技術(shù)使很多不孕患者獲得子代，但是仍然有約10%的患者經(jīng)歷著反復(fù)種植失敗。因此，不明原因反復(fù)種植失敗(unexplained repeated implantation failure, uRIF)是目前急需解決的一大難題[1]。uRIF是指≥3次胚胎移植中至少有一個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎或多次胚胎移植累計(jì)移植胚胎數(shù)超過10枚仍未獲得臨床妊娠，而未發(fā)現(xiàn)任何影響胚胎移植的全身因素和子宮局部因素[2-3]。盡管反復(fù)移植失敗病因復(fù)雜多樣，但是生殖專家一直在努力尋找其病因及解決辦法，如宮腹腔鏡檢查除外子宮內(nèi)外環(huán)境、胚胎移植時(shí)間調(diào)整、應(yīng)用各種藥物改善子宮內(nèi)膜容受性等，而療效并不顯著[4-5]。人粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)是一種正向調(diào)節(jié)粒系細(xì)胞分化的細(xì)胞因子，可一定程度促使其分化、增殖，還可調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡[6-7]。事實(shí)上，G-CSF還可作用于人體內(nèi)的多種成熟細(xì)胞，參與其正常生理功能的發(fā)揮。研究發(fā)現(xiàn)，G-CSF在人妊娠過程中具有非常重要的作用，它參與了人卵泡、胎盤及子宮內(nèi)膜的生長(zhǎng)發(fā)育，是胚胎著床過程中非常重要的一種細(xì)胞因子[8-9]。故本研究擬對(duì)uRIF患者胚胎移植前及移植后第3、5日分別皮下注射重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony stimulating factor, rh G-CSF)，旨在觀察rh G-CSF對(duì)uRIF患者療效。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象及分組 本研究選擇2018年1月—2019年4月因輸卵管因素或男方因素在我院生殖醫(yī)學(xué)科行IVF-ET的uRIF患者120例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①取卵年齡≤38歲；②既往經(jīng)歷3個(gè)移植周期，每周期均移植1～2個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎未獲妊娠者，此次為第四次凍融胚胎移植(frozen embryo transfer, FET)；③至少剩余2個(gè)胚胎(卵裂期或囊胚期胚胎)凍存，其中有≥1個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往子宮內(nèi)膜厚度≤8 mm，伴子宮內(nèi)膜息肉、宮腔積液、輸卵管積水者；②有內(nèi)分泌及代謝紊亂、血栓形成傾向或抗磷脂綜合征者；③剩余胚胎<2個(gè)。所有患者根據(jù)藥物治療方法的不同均分為觀察組和對(duì)照組。兩組取卵年齡、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)及移植日子宮內(nèi)膜厚度等比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

表1 不同藥物治療的體外受精-胚胎移植不明原因反復(fù)種植失敗兩組基本情況比較

注：觀察組為予重組人粒細(xì)胞集落刺激因子聯(lián)合常規(guī)黃體支持治療的體外受精-胚胎移植不明原因反復(fù)種植失敗患者組，對(duì)照組為僅予常規(guī)黃體支持治療的體外受精-胚胎移植不明原因反復(fù)種植失敗患者組

1.2 治療方法 月經(jīng)規(guī)律患者選擇自然排卵周期行FET，從月經(jīng)第10日開始監(jiān)測(cè)卵泡和內(nèi)膜，當(dāng)卵泡直徑≥18 mm或內(nèi)源性促黃體生成素(LH)>20 mU/ml時(shí)，應(yīng)用人β絨毛膜促性腺激素(β-HCG)6000 U誘導(dǎo)排卵,并行內(nèi)膜轉(zhuǎn)換，排卵后第3日或第5日行FET。月經(jīng)周期紊亂者行激素替代周期或促排卵周期FET，激素替代周期FET者從月經(jīng)來潮第3日起予戊酸雌二醇片(廣州拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字：J20130009)每次1 mg、每日2次口服，每4日增加戊酸雌二醇片2 mg直至最大劑量12 mg/d，待子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm時(shí)予內(nèi)膜轉(zhuǎn)化，同時(shí)檢測(cè)血雌激素(E2)和孕酮(P)水平，內(nèi)膜轉(zhuǎn)化后第3日或第5日予FET；促排卵周期FET者從月經(jīng)來潮第3日起予來曲唑(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字：H19991001)2.5 mg/d口服，連用5 d，后聯(lián)合或不聯(lián)合應(yīng)用人絕經(jīng)期促性腺激素(麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字：H10940097)75～150 U/d和(或)戊酸雌二醇片2～4 mg/d，超聲監(jiān)測(cè)卵泡大小和子宮內(nèi)膜厚度，當(dāng)卵泡直徑≥18 mm或內(nèi)源性LH>20 mU/ml時(shí)，應(yīng)用β-HCG 6000 U誘導(dǎo)排卵,并行內(nèi)膜轉(zhuǎn)換，排卵后第3日或第5日行FET。

對(duì)照組在FET期間僅行常規(guī)黃體支持，排卵周期黃體支持方案為黃體酮軟膠囊[博賞醫(yī)藥咨詢(上海)有限公司生產(chǎn)，注冊(cè)證號(hào)：H20160265] 陰道給藥，每次200 mg、每日1次，聯(lián)合地屈孕酮片[雅培貿(mào)易(上海)有限公司生產(chǎn),注冊(cè)證號(hào)：H20170221]口服，每次20 mg、每日2次；激素替代周期黃體支持方案為黃體酮軟膠囊陰道給藥，每次200 mg、每日2次，聯(lián)合地屈孕酮片口服，每次20 mg、每日2次。移植后12～14 d查血β-HCG，陰性者停藥，陽性者繼續(xù)用藥至移植后8～10周。觀察組在對(duì)照組治療基礎(chǔ)上加用rh G-CSF治療，胚胎移植前1 h皮下注射rh G-CSF(華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字：S19991017)300 U，胚胎移植后第3、5日分別皮下注射rh G-CSF 150 U。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察兩組此次FET的生化妊娠率、臨床妊娠率、胚胎種植率、流產(chǎn)率，以及不良反應(yīng)和預(yù)后。生化妊娠率=生化妊娠周期數(shù)/移植周期總數(shù)×100%，臨床妊娠率=臨床妊娠總數(shù)/移植周期總數(shù)×100%，胚胎種植率=著床胚胎總數(shù)/胚胎移植總數(shù)×100%，流產(chǎn)率=流產(chǎn)的周期總數(shù)/臨床妊娠周期總數(shù)×100%。移植后第12日或第14日血β-HCG>25 mU/ml為生化妊娠，移植后4周超聲下看到孕囊為臨床妊娠。

2 結(jié)果

2.1 兩組子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備過程中E2、LH及P水平比較 內(nèi)膜準(zhǔn)備過程中自然周期、促排卵周期兩組排卵日E2、LH及P水平和人工周期內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日E2及P水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 不同藥物治療的體外受精-胚胎移植不明原因反復(fù)種植失敗兩組內(nèi)膜準(zhǔn)備過程中E2、LH及P比較

注：觀察組為予重組人粒細(xì)胞集落刺激因子聯(lián)合常規(guī)黃體支持治療的體外受精-胚胎移植不明原因反復(fù)種植失敗患者組，對(duì)照組為僅予常規(guī)黃體支持治療的體外受精-胚胎移植不明原因反復(fù)種植失敗患者組；LH為促黃體生成素、E2為雌激素、P為孕酮，且自然周期和促排卵周期均為排卵日數(shù)據(jù)，人工周期為內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日數(shù)據(jù)；自然周期觀察組28例、對(duì)照組30例，促排卵周期觀察組12例、對(duì)照組14例，人工周期觀察組20例、對(duì)照組16例

2.2 兩組移植胚胎情況比較 兩組此次移植胚胎類別、移植胚胎數(shù)及優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 不同藥物治療的體外受精-胚胎移植不明原因反復(fù)種植失敗兩組移植胚胎情況比較

注：觀察組為予重組人粒細(xì)胞集落刺激因子聯(lián)合常規(guī)黃體支持治療的體外受精-胚胎移植不明原因反復(fù)種植失敗患者組，對(duì)照組為僅予常規(guī)黃體支持治療的體外受精-胚胎移植不明原因反復(fù)種植失敗患者組

2.3 兩組臨床結(jié)局比較 觀察組生化妊娠率和臨床妊娠率均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表4。觀察組胚胎種植率為39.7%(46/116)高于對(duì)照組胚胎種植率26.9%(28/104)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.982，P=0.048)，但觀察組和對(duì)照組流產(chǎn)率分別為14.7%(5/34)、20.0%(4/20)，比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.247，P=0.633)。

表4 不同藥物治療的體外受精-胚胎移植不明原因反復(fù)種植失敗兩組臨床結(jié)局比較[例(%)]

注：觀察組為予重組人粒細(xì)胞集落刺激因子聯(lián)合常規(guī)黃體支持治療的體外受精-胚胎移植不明原因反復(fù)種植失敗患者組，對(duì)照組為僅予常規(guī)黃體支持治療的體外受精-胚胎移植不明原因反復(fù)種植失敗患者組

2.4 不良反應(yīng)及預(yù)后 觀察組僅2例出現(xiàn)輕微發(fā)熱(<38℃)，第2日自行緩解，無其他不良反應(yīng)。對(duì)照組中3例移植后成功妊娠，但孕近2個(gè)月時(shí)胚胎停育，行清宮術(shù)，胚胎絨毛染色體無異常；1例胚胎移植后輸卵管妊娠，腹腔下切除患者輸卵管。觀察組中4例移植后成功妊娠，孕近2個(gè)月時(shí)胚胎停育，行清宮術(shù)，胚胎絨毛染色體無異常；1例自然流產(chǎn)，未行清宮術(shù)。

3 討論

胚胎植入是一個(gè)成功的半同種移植，其成功有賴于發(fā)育潛能高的胚胎、良好的子宮內(nèi)膜及母體對(duì)胚胎的免疫耐受[10]。胚胎來源的滋養(yǎng)層細(xì)胞向母體子宮內(nèi)膜的遷移、浸潤(rùn)是正常胚胎植入及胎盤形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[11]。由于G-CSF受體主要存在于胎盤組織和滋養(yǎng)層細(xì)胞，因此推測(cè)G-CSF可能具有調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞植入和維持早期妊娠的作用[12-13]。子宮內(nèi)膜中的T細(xì)胞主要分布于功能層，包含豐富的T細(xì)胞亞群。CD4+ T細(xì)胞激活后按分泌細(xì)胞因子譜分為Th1型和Th2型兩個(gè)功能亞群。大量研究表明，Th1型細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答不利于妊娠，而Th2型細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答有利于妊娠[14-15]。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，G-CSF不斷重復(fù)刺激能維持G-CSF受體在CD4+ T細(xì)胞上的表達(dá)量[16]，這可能是G-CSF對(duì)T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的重要機(jī)制。G-CSF抑制T細(xì)胞的異種反應(yīng)性，使T細(xì)胞處于免疫低反應(yīng)狀態(tài)。G-CSF可以誘導(dǎo)T細(xì)胞的應(yīng)答不足并促進(jìn)T細(xì)胞由Th1型向Th2型分化[17-18]。因此，子宮內(nèi)膜局部的免疫異?？赡苁菍?dǎo)致uRIF的原因。

反復(fù)種植失敗病因非常復(fù)雜，涉及范圍較為廣泛，主要包括配子或胚胎質(zhì)量及其發(fā)育潛能、子宮內(nèi)膜容受性和局部免疫狀態(tài)等多個(gè)方面。對(duì)于uRIF患者而言，雖然治療方法多種多樣，如各種藥物及子宮內(nèi)膜輕微搔刮術(shù)改善內(nèi)膜容受性和淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療調(diào)節(jié)母體免疫等，但是療效并不顯著[19]。2009年Scarpellini和 Sbracia[20]首次提出對(duì)患有復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion, RSA)的夫婦孕前應(yīng)用rh G-CSF直到孕19周，治療組的妊娠率和活產(chǎn)率顯著高于對(duì)照組，且新生兒未發(fā)現(xiàn)明顯的畸形。2013年，Gleicher等[21]對(duì)體外受精且有RSA史患者應(yīng)用G-CSF獲得較好的妊娠結(jié)局。

本研究?jī)?nèi)膜準(zhǔn)備過程中兩組E2、LH及P水平無明顯差異，移植日子宮內(nèi)膜厚度差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；觀察組較對(duì)照組明顯提高了生化妊娠率、臨床妊娠率和胚胎種植率。兩組移植胚胎數(shù)目及優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)均無差異，推測(cè)可能是母胎界面免疫細(xì)胞因子調(diào)節(jié)，促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和侵襲，改善了子宮內(nèi)膜局部免疫所致。已有研究證實(shí)，G-CSF可刺激自然移植物的細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞增殖并抑制其凋亡，在G-CSF的作用下滋養(yǎng)細(xì)胞偽足增多、變長(zhǎng)，侵襲能力增強(qiáng)[22]。故G-CSF對(duì)母胎界面具有雙向調(diào)節(jié)作用，一方面對(duì)免疫細(xì)胞具有一定抑制作用，另一方面對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)功能具有很好的促進(jìn)作用[23]。

G-CSF經(jīng)靜脈或皮下注射后主要分布在腎臟、骨髓和血漿中，以氨基酸代謝途徑被降解，并主要由尿排泄。本藥在腫瘤領(lǐng)域中應(yīng)用已近20年，尚未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)和致畸報(bào)道。Scarpellini和Sbracia[20]對(duì)35例RSA患者在妊娠前及妊娠期間皮下應(yīng)用G-CSF達(dá)9周，并未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)和胎兒先天性異常。目前研究表明，在安全劑量范圍內(nèi)應(yīng)用G-CSF不影響母體健康及胎兒健康；無論哪種給藥方法, 用藥48 h后檢測(cè)尿中藥物濃度及血中藥物濃度均在臨界值以下[24]。但是G-CSF靜脈及皮下注射時(shí)可能存在一些風(fēng)險(xiǎn)及輕微不良反應(yīng),如腰痛、胸痛、骨痛、發(fā)熱、頭痛、倦怠、心悸等不適,偶有皮膚發(fā)紅、皮疹、食欲不振、惡心、嘔吐等消化道反應(yīng)及肝損害等。對(duì)于出現(xiàn)疼痛者可口服吲哚美辛或肌內(nèi)注射異丙嗪對(duì)癥治療，余不適無需特殊處理[25]。本研究觀察組中僅2例出現(xiàn)發(fā)熱，均低于38℃，第2日自行緩解，余患者無其他不適。

總之，rh G-CSF能改善uRIF患者再次解凍移植的妊娠結(jié)局，且應(yīng)用安全性較好。但因本研究樣本量較少，未研究rh G-CSF對(duì)胚胎植入的作用機(jī)制，將來需設(shè)計(jì)更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾S機(jī)對(duì)照研究探討rh G-CSF在生殖免疫方面的作用和機(jī)制，以及其規(guī)范治療方案、給藥方式、嚴(yán)格的適應(yīng)證及禁忌證。