王靜 洪炳哲 張習(xí)敬 葛魯敏 任海勤

(1貴州盤江投資控股(集團)有限公司總醫(yī)院心內(nèi)科，貴州 六盤水 553530；2齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院心內(nèi)科六病區(qū))

急性心肌梗死的主要表現(xiàn)形式為心肌細(xì)胞凋亡，研究表明冠狀動脈閉塞后造成局部心肌組織缺血缺氧進而導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡〔1〕。急性心肌梗死可促使心肌細(xì)胞因缺血缺氧而發(fā)生細(xì)胞凋亡，通過抑制心肌細(xì)胞凋亡可延緩心室重構(gòu)并減少心肌梗死面積，既往研究報道指出心肌梗死后引發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡是造成心力衰竭等心血管疾病發(fā)生的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)〔2,3〕。因而如何減少心肌細(xì)胞凋亡成為目前研究的主要方向。山藥多糖(CYPS)是山藥的主要成分且屬于補氣中藥，研究表明CYPS在神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮抗氧化等作用〔4,5〕。但CYPS對急性心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡的影響尚未可知。上調(diào)成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)9表達可減少缺氧/復(fù)氧(H/R)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡〔6〕。FGF9屬于成纖維生長因子家族成員，其表達異常與多種血管疾病發(fā)生及發(fā)展過程密切相關(guān)〔7〕。但CYPS是否可通過調(diào)控FGF9表達進而參與心肌細(xì)胞凋亡過程尚未見相關(guān)報道。本研究通過觀察CYPS對H/R后心肌細(xì)胞存活及凋亡的影響，探討其對FGF9表達的影響及其調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 心肌細(xì)胞H9C2購自上海酶研生物科技有限公司。siRNA轉(zhuǎn)染試劑購自德國羅氏公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；噻唑藍(MTT)檢測試劑盒購自美國Sigma公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海貝博生物公司；放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒均購自上海碧云天生物工程有限公司；兔抗鼠活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved caspase)-3、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)4單克隆抗體購自美國Abcam公司；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)含量檢測試劑盒均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2構(gòu)建H/R模型 DMEM低糖培養(yǎng)基充入無菌氮氣，以1 L/min的流量持續(xù)30 min，將原培養(yǎng)基更換為DMEM高糖培養(yǎng)基，放入缺氧裝置內(nèi)進行缺氧處理4 h，充入氧氣進行復(fù)氧處理2 h〔8〕。未進行任何處理的心肌細(xì)胞作為空白對照(NC)組，H/R處理的心肌細(xì)胞作為H/R組。

1.3藥物處理及實驗分組 收集處于對數(shù)生長期心肌細(xì)胞，隨機分為3組：H/R+75 mg/L CYPS組(心肌細(xì)胞缺氧時加入終濃度為75 mg/L 的CYPS進行H/R處理)、H/R+150 mg/L CYPS組(心肌細(xì)胞缺氧時加入終濃度為150 mg/L 的CYPS進行H/R處理)、H/R+300 mg/L CYPS組(心肌細(xì)胞缺氧時加入終濃度為300 mg/L 的CYPS后進行H/R處理)〔9〕，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。后續(xù)實驗首先觀察過表達FGF9對缺氧處理心肌細(xì)胞存活率和細(xì)胞凋亡的影響，將心肌細(xì)胞隨機分為H/R+pcDNA組、H/R+pcDNA-FGF9組，將心肌細(xì)胞隨機分為H/R+CYPS組(心肌細(xì)胞缺氧時加入終濃度為300 mg/L 的CYPS進行H/R處理)、H/R+CYPS+si-con組(心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染FGF9-siRNA的陰性對照，轉(zhuǎn)染成功后在心肌細(xì)胞缺氧時加入終濃度為300 mg/L 的CYPS進行H/R處理)、H/R+CYPS+si-FGF9組(心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染FGF9-siRNA，轉(zhuǎn)染成功后在心肌細(xì)胞缺氧時加入終濃度為300 mg/L的CYPS進行H/R處理)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4MTT檢測細(xì)胞存活率 收集對數(shù)生長期心肌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度(5×104個/ml)，以每孔1 ml接種于96孔板，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按照實驗分組處理后，每孔分別加入10 μl MTT試劑，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，分別于作用24 h、48 h、72 h、96 h時棄細(xì)胞上清液，每孔分別加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，放入搖床上低速振蕩10 min，充分反應(yīng)，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測波長為490 nm時各孔吸光度值(OD值)，空白對照組僅添加等量培養(yǎng)液，每組均設(shè)置3個復(fù)孔，細(xì)胞存活率=〔(實驗組OD值-空白對照組OD值)/(正常對照組OD值-空白對照組OD值)〕×100%。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 收集各組心肌細(xì)胞，棄上清，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，低溫條件下，1 500 r/min離心5 min(離心半徑10 cm)，棄上清，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，加入400 μl結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL，加入5 μl Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)染色液，充分混勻后，室溫避光孵育15 min，加入10 μl碘化丙啶(PI)染色液，充分混勻，室溫避光孵育5 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.6實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測細(xì)胞中FGF9 mRNA表達水平 采用Trizol法提取心肌細(xì)胞總RNA，測定RNA濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，嚴(yán)格按照qRT-PCR檢測試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，采用2-ΔΔCt法計算FGF9 mRNA相對表達量。

1.7Western印跡檢測心肌細(xì)胞CDK4、Cleaved caspase-3、FGF9蛋白表達 取各組對數(shù)生長期心肌細(xì)胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min后進行離心，離心條件為4℃，12 000 r/min轉(zhuǎn)速，離心15 min(離心半徑6 cm)，收集上清液即細(xì)胞總蛋白，采用BCA法檢測蛋白含量，根據(jù)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒配置分離膠，取20 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE，電泳反應(yīng)條件為80 V 30 min，120 V 90 min，120 V、2 000 mA條件下轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫條件下用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗滌3次×10 min，4℃孵育一抗(1∶1 000)過夜，TBST洗滌3次×10 min，室溫孵育二抗(1∶20 000)2 h，Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBST)洗滌3次×10 min，滴加ECL顯影，放入凝膠成像系統(tǒng)并應(yīng)用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.8檢測GSH-Px、SOD含量 采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活力，采用還原型谷胱甘肽氧化法檢測GSH-Px活力，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1CYPS對H/R處理心肌細(xì)胞存活率、GSH-Px、SOD含量及CDK4表達的影響 H/R組心肌細(xì)胞存活率顯著低于NC組(P<0.05)，不同濃度CYPS干預(yù)后心肌細(xì)胞存活率顯著高于H/R組(P<0.05)，且隨著CYPS濃度的增加而顯著升高(P<0.05)。與NC組相比，H/R組心肌細(xì)胞中CDK4蛋白水平及GSH-Px、SOD含量均顯著降低(P<0.05)；相對于H/R組，H/R+75 mg/L CYPS組、H/R+150 mg/L CYPS組、H/R+300 mg/L CYPS組心肌細(xì)胞中CDK4蛋白水平及GSH-Px、SOD含量均顯著升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性，見表1、圖1。

表1 不同濃度的CYPS對缺氧處理心肌細(xì)胞存活率和GSH-Px及SOD含量的影響

1)與NC組比較，2)與H/R組比較，3)與H/R+75 mg/L CYPS組比較，4)與H/R+150 mg/L CYPS組比較：均P<0.05,表2同

1～5：NC組，H/R組，H/R+75 mg/L CYPS組，H/R+150 mg/L CYPS組，H/R+300 mg/L CYPS組；圖2同圖1 不同濃度的CYPS對H/R處理心肌細(xì)胞CDK4含量的影響

2.2CYPS對H/R處理心肌細(xì)胞凋亡的影響 H/R組心肌細(xì)胞凋亡率顯著高于NC組(P<0.05)，不同濃度CYPS干預(yù)后心肌細(xì)胞凋亡率顯著低于H/R組(P<0.05)，且隨著濃度的增加而顯著降低(P<0.05)。與NC組相比，H/R組心肌細(xì)胞中Cleaved caspase-3蛋白水平顯著升高(P<0.05)；相對于H/R組，H/R+75 mg/L CYPS組、H/R+150 mg/L CYPS組、H/R+300 mg/L CYPS組心肌細(xì)胞中Cleaved caspase-3蛋白水平顯著降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性，見表2、圖2。

2.3CYPS對H/R處理心肌細(xì)胞FGF9表達的影響 H/R組心肌細(xì)胞FGF9 mRNA及蛋白水平顯著低于NC組(P<0.05)，不同濃度CYPS干預(yù)后心肌細(xì)胞FGF9 mRNA及蛋白水平顯著高于H/R組(P<0.05)，且隨著濃度的增加而顯著升高(P<0.05)，見表2，圖3。

2.4過表達FGF9對H/R處理心肌細(xì)胞存活率和細(xì)胞凋亡的影響 與H/R+pcDNA組相比，H/R+pcDNA-FGF9組心肌細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05)，而細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，GSH-Px、SOD含量及CDK4、FGF9蛋白水平均顯著升高(P<0.05)，而Cleaved caspase-3蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見圖3、表3。表明FGF9過表達可明顯促進H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖而抑制細(xì)胞凋亡。

2.5沉默F(xiàn)GF9逆轉(zhuǎn)CYPS對H/R處理心肌細(xì)胞的保護作用 相對于H/R+CYPS+si-con組，H/R+CYPS+si-FGF9組心肌細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)，而細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，GSH-Px、SOD含量及CDK4、FGF9蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，而Cleaved caspase-3蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見表4、圖4。表明CYPS可通過上調(diào)FGF9表達而保護心肌細(xì)胞。

表2 不同濃度的CYPS對缺氧處理心肌細(xì)胞凋亡和Cleaved caspase-3、FGF9蛋白及mRNA表達的影響

圖2 不同濃度的CYPS對缺氧處理心肌細(xì)胞Cleaved caspase-3、FGF9蛋白表達的影響

1～4：NC組，H/R組，H/R+pcDNA組，H/R+pcDNA+FGF9組圖3 過表達FGF9對H/R處理心肌細(xì)胞CDK4和Cleaved caspase-3表達的影響

表3 過表達FGF9對缺氧處理心肌細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡、GSH-Px和SOD含量及CDK4和Cleaved caspase-3表達的影響

與NC組相比較：1)P<0.05；與H/R+pcDNA組相比較：2)P<0.05

表4 CYPS和降低FGF9表達對缺氧處理心肌細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡、GSH-Px和SOD含量及CDK4和Cleaved caspase-3表達的影響

與NC組相比較：1)P<0.05；與H/R組相比較：2)P<0.05；與H/R+CYPS+si-con組相比：3)P<0.05

1～5：NC組，H/R組，H/R+CYPS組，H/R+CYPS+si-con組，H/R+CYPS+si-FGF9組圖4 CYPS和沉默F(xiàn)GF9表達對缺氧處理心肌細(xì)胞FGF9、CDK4和Cleaved caspase-3蛋白表達的影響

3 討 論

心肌梗死區(qū)域心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高，心肌缺血、缺氧等均可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。研究指出，減少心肌細(xì)胞凋亡可減少心肌梗死面積并延緩心室重構(gòu)〔10〕。因而減少心肌細(xì)胞凋亡成為治療心肌梗死的主要途徑。既往研究表明，從植物中提取多糖成分可有效保護心肌梗死后的心肌細(xì)胞，并抑制H/R所致的心肌細(xì)胞凋亡〔11〕。

CYPS可通過降低糖尿病大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)有效改善大鼠血糖水平，并可保護胰島及血小板功能〔12〕。CYPS可通過增強腦組織中三磷酸腺苷(ATP)酶活性增強機體清除氧自由基能力進而防止老年性癡呆〔13〕。研究表明，CYPS可增強肝癌細(xì)胞對胰島素的敏感性及改善細(xì)胞葡萄糖消耗能力〔14〕。本研究結(jié)果提示CYPS可通過促進CDK4表達進而促進心肌細(xì)胞存活。CDK4是正向調(diào)控細(xì)胞周期的重要因子之一，CDK激活后可與Cyclin形成復(fù)合物進而促進細(xì)胞周期由G1期進入S期，促進細(xì)胞增殖〔15〕。GSH-Px與SOD可構(gòu)成機體抗氧化防御系統(tǒng)，其含量升高可增強機體抗氧化能力〔16〕。本研究結(jié)果提示CYPS可有效提高H/R損傷心肌細(xì)胞自由基清除能力，并有效降低氧化應(yīng)激損傷。Cleaved caspase-3是線粒體凋亡途徑中執(zhí)行凋亡的重要因子，其表達水平升高可促進細(xì)胞凋亡〔17〕。本研究提示，CYPS可通過降低Cleaved caspase-3表達進而抑制H/R導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡。

FGF9廣泛存在于哺乳動物中樞神經(jīng)或外周神經(jīng)系統(tǒng)中，并可有效促進神經(jīng)元細(xì)胞生長，若神經(jīng)元受損時可明顯促進神經(jīng)元再生并有效延緩神經(jīng)元細(xì)胞死亡〔18，19〕。FGF9能夠介導(dǎo)單核細(xì)胞向M2分化，賦予心臟保護作用〔20〕。本研究提示，CYPS可通過上調(diào)FGF9表達而對H/R損傷心肌細(xì)胞發(fā)揮保護作用。

綜上，CYPS可有效保護H/R損傷心肌細(xì)胞，可能與上調(diào)FGF9表達及增強抗氧化能力有關(guān)，并可降低心肌細(xì)胞凋亡率，為臨床合理用藥提供參考依據(jù)。但關(guān)于CYPS對H/R損傷心肌細(xì)胞保護作用的其他作用機制仍需深入研究。