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        山藥多糖對大鼠急性心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用及其機制

        2020-04-29 02:45:06王靜洪炳哲張習(xí)敬葛魯敏任海勤
        中國老年學(xué)雜志 2020年8期
        關(guān)鍵詞:存活率心肌細(xì)胞試劑盒

        王靜 洪炳哲 張習(xí)敬 葛魯敏 任海勤

        (1貴州盤江投資控股(集團)有限公司總醫(yī)院心內(nèi)科,貴州 六盤水 553530;2齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院心內(nèi)科六病區(qū))

        急性心肌梗死的主要表現(xiàn)形式為心肌細(xì)胞凋亡,研究表明冠狀動脈閉塞后造成局部心肌組織缺血缺氧進而導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡〔1〕。急性心肌梗死可促使心肌細(xì)胞因缺血缺氧而發(fā)生細(xì)胞凋亡,通過抑制心肌細(xì)胞凋亡可延緩心室重構(gòu)并減少心肌梗死面積,既往研究報道指出心肌梗死后引發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡是造成心力衰竭等心血管疾病發(fā)生的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)〔2,3〕。因而如何減少心肌細(xì)胞凋亡成為目前研究的主要方向。山藥多糖(CYPS)是山藥的主要成分且屬于補氣中藥,研究表明CYPS在神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮抗氧化等作用〔4,5〕。但CYPS對急性心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡的影響尚未可知。上調(diào)成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)9表達可減少缺氧/復(fù)氧(H/R)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡〔6〕。FGF9屬于成纖維生長因子家族成員,其表達異常與多種血管疾病發(fā)生及發(fā)展過程密切相關(guān)〔7〕。但CYPS是否可通過調(diào)控FGF9表達進而參與心肌細(xì)胞凋亡過程尚未見相關(guān)報道。本研究通過觀察CYPS對H/R后心肌細(xì)胞存活及凋亡的影響,探討其對FGF9表達的影響及其調(diào)控作用。

        1 材料與方法

        1.1材料與試劑 心肌細(xì)胞H9C2購自上海酶研生物科技有限公司。siRNA轉(zhuǎn)染試劑購自德國羅氏公司;DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司;胎牛血清購自美國Gibco公司;噻唑藍(MTT)檢測試劑盒購自美國Sigma公司;細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海貝博生物公司;放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒均購自上海碧云天生物工程有限公司;兔抗鼠活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved caspase)-3、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)4單克隆抗體購自美國Abcam公司;Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司;谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)含量檢測試劑盒均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

        1.2構(gòu)建H/R模型 DMEM低糖培養(yǎng)基充入無菌氮氣,以1 L/min的流量持續(xù)30 min,將原培養(yǎng)基更換為DMEM高糖培養(yǎng)基,放入缺氧裝置內(nèi)進行缺氧處理4 h,充入氧氣進行復(fù)氧處理2 h〔8〕。未進行任何處理的心肌細(xì)胞作為空白對照(NC)組,H/R處理的心肌細(xì)胞作為H/R組。

        1.3藥物處理及實驗分組 收集處于對數(shù)生長期心肌細(xì)胞,隨機分為3組:H/R+75 mg/L CYPS組(心肌細(xì)胞缺氧時加入終濃度為75 mg/L 的CYPS進行H/R處理)、H/R+150 mg/L CYPS組(心肌細(xì)胞缺氧時加入終濃度為150 mg/L 的CYPS進行H/R處理)、H/R+300 mg/L CYPS組(心肌細(xì)胞缺氧時加入終濃度為300 mg/L 的CYPS后進行H/R處理)〔9〕,放入37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。后續(xù)實驗首先觀察過表達FGF9對缺氧處理心肌細(xì)胞存活率和細(xì)胞凋亡的影響,將心肌細(xì)胞隨機分為H/R+pcDNA組、H/R+pcDNA-FGF9組,將心肌細(xì)胞隨機分為H/R+CYPS組(心肌細(xì)胞缺氧時加入終濃度為300 mg/L 的CYPS進行H/R處理)、H/R+CYPS+si-con組(心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染FGF9-siRNA的陰性對照,轉(zhuǎn)染成功后在心肌細(xì)胞缺氧時加入終濃度為300 mg/L 的CYPS進行H/R處理)、H/R+CYPS+si-FGF9組(心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染FGF9-siRNA,轉(zhuǎn)染成功后在心肌細(xì)胞缺氧時加入終濃度為300 mg/L的CYPS進行H/R處理),繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

        1.4MTT檢測細(xì)胞存活率 收集對數(shù)生長期心肌細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度(5×104個/ml),以每孔1 ml接種于96孔板,放入37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h,按照實驗分組處理后,每孔分別加入10 μl MTT試劑,放入37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h,分別于作用24 h、48 h、72 h、96 h時棄細(xì)胞上清液,每孔分別加入150 μl二甲基亞砜(DMSO),放入搖床上低速振蕩10 min,充分反應(yīng),應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測波長為490 nm時各孔吸光度值(OD值),空白對照組僅添加等量培養(yǎng)液,每組均設(shè)置3個復(fù)孔,細(xì)胞存活率=〔(實驗組OD值-空白對照組OD值)/(正常對照組OD值-空白對照組OD值)〕×100%。

        1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 收集各組心肌細(xì)胞,棄上清,用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞,0.25%胰蛋白酶消化,低溫條件下,1 500 r/min離心5 min(離心半徑10 cm),棄上清,預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞,加入400 μl結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL,加入5 μl Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)染色液,充分混勻后,室溫避光孵育15 min,加入10 μl碘化丙啶(PI)染色液,充分混勻,室溫避光孵育5 min,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

        1.6實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測細(xì)胞中FGF9 mRNA表達水平 采用Trizol法提取心肌細(xì)胞總RNA,測定RNA濃度,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,嚴(yán)格按照qRT-PCR檢測試劑盒說明書配制反應(yīng)體系,采用2-ΔΔCt法計算FGF9 mRNA相對表達量。

        1.7Western印跡檢測心肌細(xì)胞CDK4、Cleaved caspase-3、FGF9蛋白表達 取各組對數(shù)生長期心肌細(xì)胞,加入RIPA裂解液,冰上裂解30 min后進行離心,離心條件為4℃,12 000 r/min轉(zhuǎn)速,離心15 min(離心半徑6 cm),收集上清液即細(xì)胞總蛋白,采用BCA法檢測蛋白含量,根據(jù)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒配置分離膠,取20 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE,電泳反應(yīng)條件為80 V 30 min,120 V 90 min,120 V、2 000 mA條件下轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,室溫條件下用5%脫脂奶粉封閉2 h,TBST洗滌3次×10 min,4℃孵育一抗(1∶1 000)過夜,TBST洗滌3次×10 min,室溫孵育二抗(1∶20 000)2 h,Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBST)洗滌3次×10 min,滴加ECL顯影,放入凝膠成像系統(tǒng)并應(yīng)用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值。

        1.8檢測GSH-Px、SOD含量 采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活力,采用還原型谷胱甘肽氧化法檢測GSH-Px活力,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。

        1.9統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析。

        2 結(jié) 果

        2.1CYPS對H/R處理心肌細(xì)胞存活率、GSH-Px、SOD含量及CDK4表達的影響 H/R組心肌細(xì)胞存活率顯著低于NC組(P<0.05),不同濃度CYPS干預(yù)后心肌細(xì)胞存活率顯著高于H/R組(P<0.05),且隨著CYPS濃度的增加而顯著升高(P<0.05)。與NC組相比,H/R組心肌細(xì)胞中CDK4蛋白水平及GSH-Px、SOD含量均顯著降低(P<0.05);相對于H/R組,H/R+75 mg/L CYPS組、H/R+150 mg/L CYPS組、H/R+300 mg/L CYPS組心肌細(xì)胞中CDK4蛋白水平及GSH-Px、SOD含量均顯著升高(P<0.05),且呈劑量依賴性,見表1、圖1。

        表1 不同濃度的CYPS對缺氧處理心肌細(xì)胞存活率和GSH-Px及SOD含量的影響

        1)與NC組比較,2)與H/R組比較,3)與H/R+75 mg/L CYPS組比較,4)與H/R+150 mg/L CYPS組比較:均P<0.05,表2同

        1~5:NC組,H/R組,H/R+75 mg/L CYPS組,H/R+150 mg/L CYPS組,H/R+300 mg/L CYPS組;圖2同圖1 不同濃度的CYPS對H/R處理心肌細(xì)胞CDK4含量的影響

        2.2CYPS對H/R處理心肌細(xì)胞凋亡的影響 H/R組心肌細(xì)胞凋亡率顯著高于NC組(P<0.05),不同濃度CYPS干預(yù)后心肌細(xì)胞凋亡率顯著低于H/R組(P<0.05),且隨著濃度的增加而顯著降低(P<0.05)。與NC組相比,H/R組心肌細(xì)胞中Cleaved caspase-3蛋白水平顯著升高(P<0.05);相對于H/R組,H/R+75 mg/L CYPS組、H/R+150 mg/L CYPS組、H/R+300 mg/L CYPS組心肌細(xì)胞中Cleaved caspase-3蛋白水平顯著降低(P<0.05),且呈劑量依賴性,見表2、圖2。

        2.3CYPS對H/R處理心肌細(xì)胞FGF9表達的影響 H/R組心肌細(xì)胞FGF9 mRNA及蛋白水平顯著低于NC組(P<0.05),不同濃度CYPS干預(yù)后心肌細(xì)胞FGF9 mRNA及蛋白水平顯著高于H/R組(P<0.05),且隨著濃度的增加而顯著升高(P<0.05),見表2,圖3。

        2.4過表達FGF9對H/R處理心肌細(xì)胞存活率和細(xì)胞凋亡的影響 與H/R+pcDNA組相比,H/R+pcDNA-FGF9組心肌細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05),而細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05),GSH-Px、SOD含量及CDK4、FGF9蛋白水平均顯著升高(P<0.05),而Cleaved caspase-3蛋白水平顯著降低(P<0.05),見圖3、表3。表明FGF9過表達可明顯促進H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖而抑制細(xì)胞凋亡。

        2.5沉默F(xiàn)GF9逆轉(zhuǎn)CYPS對H/R處理心肌細(xì)胞的保護作用 相對于H/R+CYPS+si-con組,H/R+CYPS+si-FGF9組心肌細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05),而細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05),GSH-Px、SOD含量及CDK4、FGF9蛋白水平均顯著降低(P<0.05),而Cleaved caspase-3蛋白水平顯著升高(P<0.05),見表4、圖4。表明CYPS可通過上調(diào)FGF9表達而保護心肌細(xì)胞。

        表2 不同濃度的CYPS對缺氧處理心肌細(xì)胞凋亡和Cleaved caspase-3、FGF9蛋白及mRNA表達的影響

        圖2 不同濃度的CYPS對缺氧處理心肌細(xì)胞Cleaved caspase-3、FGF9蛋白表達的影響

        1~4:NC組,H/R組,H/R+pcDNA組,H/R+pcDNA+FGF9組圖3 過表達FGF9對H/R處理心肌細(xì)胞CDK4和Cleaved caspase-3表達的影響

        表3 過表達FGF9對缺氧處理心肌細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡、GSH-Px和SOD含量及CDK4和Cleaved caspase-3表達的影響

        與NC組相比較:1)P<0.05;與H/R+pcDNA組相比較:2)P<0.05

        表4 CYPS和降低FGF9表達對缺氧處理心肌細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡、GSH-Px和SOD含量及CDK4和Cleaved caspase-3表達的影響

        與NC組相比較:1)P<0.05;與H/R組相比較:2)P<0.05;與H/R+CYPS+si-con組相比:3)P<0.05

        1~5:NC組,H/R組,H/R+CYPS組,H/R+CYPS+si-con組,H/R+CYPS+si-FGF9組圖4 CYPS和沉默F(xiàn)GF9表達對缺氧處理心肌細(xì)胞FGF9、CDK4和Cleaved caspase-3蛋白表達的影響

        3 討 論

        心肌梗死區(qū)域心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高,心肌缺血、缺氧等均可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。研究指出,減少心肌細(xì)胞凋亡可減少心肌梗死面積并延緩心室重構(gòu)〔10〕。因而減少心肌細(xì)胞凋亡成為治療心肌梗死的主要途徑。既往研究表明,從植物中提取多糖成分可有效保護心肌梗死后的心肌細(xì)胞,并抑制H/R所致的心肌細(xì)胞凋亡〔11〕。

        CYPS可通過降低糖尿病大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)有效改善大鼠血糖水平,并可保護胰島及血小板功能〔12〕。CYPS可通過增強腦組織中三磷酸腺苷(ATP)酶活性增強機體清除氧自由基能力進而防止老年性癡呆〔13〕。研究表明,CYPS可增強肝癌細(xì)胞對胰島素的敏感性及改善細(xì)胞葡萄糖消耗能力〔14〕。本研究結(jié)果提示CYPS可通過促進CDK4表達進而促進心肌細(xì)胞存活。CDK4是正向調(diào)控細(xì)胞周期的重要因子之一,CDK激活后可與Cyclin形成復(fù)合物進而促進細(xì)胞周期由G1期進入S期,促進細(xì)胞增殖〔15〕。GSH-Px與SOD可構(gòu)成機體抗氧化防御系統(tǒng),其含量升高可增強機體抗氧化能力〔16〕。本研究結(jié)果提示CYPS可有效提高H/R損傷心肌細(xì)胞自由基清除能力,并有效降低氧化應(yīng)激損傷。Cleaved caspase-3是線粒體凋亡途徑中執(zhí)行凋亡的重要因子,其表達水平升高可促進細(xì)胞凋亡〔17〕。本研究提示,CYPS可通過降低Cleaved caspase-3表達進而抑制H/R導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡。

        FGF9廣泛存在于哺乳動物中樞神經(jīng)或外周神經(jīng)系統(tǒng)中,并可有效促進神經(jīng)元細(xì)胞生長,若神經(jīng)元受損時可明顯促進神經(jīng)元再生并有效延緩神經(jīng)元細(xì)胞死亡〔18,19〕。FGF9能夠介導(dǎo)單核細(xì)胞向M2分化,賦予心臟保護作用〔20〕。本研究提示,CYPS可通過上調(diào)FGF9表達而對H/R損傷心肌細(xì)胞發(fā)揮保護作用。

        綜上,CYPS可有效保護H/R損傷心肌細(xì)胞,可能與上調(diào)FGF9表達及增強抗氧化能力有關(guān),并可降低心肌細(xì)胞凋亡率,為臨床合理用藥提供參考依據(jù)。但關(guān)于CYPS對H/R損傷心肌細(xì)胞保護作用的其他作用機制仍需深入研究。

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