趙維納 孫文強 賀夢菲 譚琳 尹昌浩 孫麗 王加良

(1牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 牡丹江 157000；2牡丹江醫(yī)學(xué)院；3牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院藥學(xué)部)

隨著我國人口老齡化的加快，血管性認(rèn)知障礙(VCI)的發(fā)病率逐年升高，尤其是血管性癡呆已占全部癡呆人群的36%，VCI包括從輕度認(rèn)知功能受損到癡呆的各種程度的認(rèn)知功能障礙〔1〕。輕度認(rèn)知功能受損癥狀較輕，易忽視，但發(fā)展至中晚期的治療效果不甚理想，極大增加治療的困難性，嚴(yán)重影響老年人的生存質(zhì)量和身心健康，因此，VCI的早期診斷和干預(yù)對VCI 治療具有積極的臨床意義〔2〕。miRNA是一類參與機體發(fā)育、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、神經(jīng)突觸形成、細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程中的非編碼單鏈核酸小分子〔3〕。miR-29家族與缺血或缺氧引發(fā)的炎癥反應(yīng)相關(guān)的VCI發(fā)生、發(fā)展有重要關(guān)系〔4〕，但血漿外泌體miR-29c在VCI中的表達和作用尚不明確，本研究擬探討血漿外泌體miR-29c在VCI患者中的表達水平及臨床意義。

1 資料與方法

1.1基礎(chǔ)資料 經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院2018年3～8月收治的68例VCI患者為觀察組，另選取65例健康志愿者為健康組，觀察組男38例，女30例；年齡55～77歲，平均(63.27±7.54)歲；VCI非癡呆35例，血管性癡呆11例，混合型癡呆22例；受教育年限6～16年，平均(10.75±1.84)年。健康組男34例，女31例，年齡54～75歲，平均(62.73±7.21)歲；受教育年限5～16年，平均(11.26±1.96)年。兩組基礎(chǔ)資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①觀察組符合《血管性認(rèn)知障礙診治指南》VCI診斷標(biāo)準(zhǔn)〔5〕，影像學(xué)檢查結(jié)果顯示存在腦血管病變灶，且存在認(rèn)知障礙；②均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①甲減、梅毒性血管炎、維生素(Vit)B12缺乏所致的認(rèn)知障礙者；②存在精神障礙者；③合并嚴(yán)重代謝性疾病、惡性腫瘤者；④嚴(yán)重視聽和語言障礙者。

1.2研究方法 (1)采用實時熒光定量聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測兩組血漿外泌體miR-29c的表達水平：①采集所有研究對象血液樣本，1 500 r/min離心5 min，收集血漿；②外泌體提取試劑盒(Norgen Biotek公司)提取外泌體；③外泌體RNA提取試劑盒(Norgen Biotek公司)提取和純化外泌體小RNA；④反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，利用qRT-PCR儀(瑞士Roche，型號：cobas z480)進行擴增，引物合成(上海生工)，上游引物：5'-CCAGCGTGTAGCACCATTT-3'，下游引物：5'-AGCAGGGTCCGAGGTATTC-3'，反應(yīng)條件：95℃，30 min；95℃，25 s；63℃，30 s；72℃，25 s；35個循環(huán)，AceQqPCRSYBR?GreenMix(南京vazyme，貨號：Q221-01)，以U6為內(nèi)參。采用2-ΔΔCt法定量分析血漿外泌體miR-29c表達水平。

(2)采用蒙特利爾認(rèn)知評估量表(MoCA)評價兩組認(rèn)知功能，包括注意(3分)、語言(5分)、執(zhí)行(3分)、記憶(6分)、視結(jié)構(gòu)技能(4分)、計算力(3分)和地點定向力(6分)，評分0～30分，分值越高，表示患者認(rèn)知功能越良好。

(3)于清晨空腹抽取肘部血液5 ml，3 000 r/min離心10 min，收集血清，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測同型半胱氨酸(Hcy)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、葉酸(FA)、VitB12，最后酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad，型號：680)上樣檢測并分析血漿外泌體miR-29c表達量與MoCA評分、血清中Hcy、CRP、FA和VitB12水平的相關(guān)性。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS25.0軟件進行t檢驗、Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組血漿外泌體miR-29c水平 觀察組血漿外泌體miR-29c表達水平(4.64±0.33)顯著高于健康組(2.72±0.15，t=42.861,P=0.000)。

2.2兩組認(rèn)知功能評分比較 觀察組MoCA總評分及注意、語言、執(zhí)行、記憶、計算力、定向力、視結(jié)構(gòu)技能評分均顯著低于健康組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.3兩組VCI指標(biāo)比較 觀察組Hcy、CRP水平顯著高于健康組(P<0.05)，F(xiàn)A和VitB12水平顯著低于健康組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.4觀察組血漿外泌體miR-29c表達量與VCI指標(biāo)的相關(guān)性 血漿外泌體miR-29c表達量與MoCA評分、FA、VitB12水平均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.705、-0.718、-0.815，P=0.001、0.000、0.000)，與Hcy、CRP水平呈正相關(guān)(r=0.724、0.729，均P=0.000)。

表1 兩組MoCA評分比較分)

表2 兩組Hcy、CRP、FA和VitB12水平比較

3 討 論

VCI是老年人常見的進展性認(rèn)知損害，是由腦血管病或存在的腦血管危險因素引起的一類獲得性認(rèn)知障礙綜合征，非癡呆型VCI患者的認(rèn)知損傷是局灶性的癥狀較輕，不易引起警覺，進而發(fā)展為癡呆，嚴(yán)重危害老年人的身心健康，目前臨床上尚未找到有效的治療手段〔6〕。miRNAs是一類長度20～24個核苷酸的非編碼單鏈RNA，血漿外泌體中富集大量miRNA，具有較強抗降解能力，miRNA的表達水平也可反映機體的生理和功能狀態(tài)，可作為疾病診斷的新型生物學(xué)標(biāo)志〔7〕。血漿外泌體源性miRNA與認(rèn)知功能障礙有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)血漿外泌體miR-422a在腦卒中發(fā)病早期的患者中表達水平顯著升高；miR-29c表達量與心血管疾病危險因素(糖尿病等)的發(fā)生發(fā)展也存在密切關(guān)系〔8，9〕，但在VCI患者中的應(yīng)用尚不清楚。

本研究結(jié)果說明VCI患者血漿外泌體中miR-29c表達水平升高，提示miR-29c與認(rèn)知功能障礙相關(guān)；VCI降低了患者注意、集中、語言、記憶和空間想象等認(rèn)知能力，致使認(rèn)知功能損傷。另外，VCI患者血清中Hcy、CRP水平升高，F(xiàn)A和VitB12水平降低。miR-29c是從神經(jīng)細(xì)胞核糖和核蛋白中發(fā)現(xiàn)并克隆出miR-29家族，位于人類的1號染色體上，具有調(diào)控人體生物學(xué)功能的作用，如細(xì)胞增殖、分化和凋亡等〔10〕。劉辰庚等〔11〕發(fā)現(xiàn)miR-29c在阿爾茨海默病患者血漿外泌體中表達量顯著降低，可用于阿爾茨海默病早期診斷的候選生物標(biāo)志物。與本研究結(jié)果相符，推測miR-29c可作為VCI疾病治療的作用靶點。Hcy是甲硫氨酸經(jīng)脫甲基后脫苷得到的一類含硫氨基酸，血清中Hcy高水平會損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，是引發(fā)腦血管疾病的危險因素，腦血管病會造成VCI，促進癡呆發(fā)展。CRP是炎癥發(fā)生時的急性炎性蛋白，血清中CRP水平與腦動脈粥樣硬化密切相關(guān)〔12〕。Zhang等〔13〕研究證實血管性癡呆患者血清中Hcy、CRP顯著高于正常人體水平，且與血管性癡呆的嚴(yán)重程度呈顯著相關(guān)性，是致使VCI的重要危險因子，與本研究結(jié)果一致。FA具有保護血管的作用，通過促進合成四氫生物喋呤，加快一氧化氮(NO)的合成和利用，增強血管舒張；VitB12是甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)甲基酶的輔酶，F(xiàn)A和VitB12是Hcy代謝的重要輔助因子〔14〕。此外，本研究結(jié)果說明血漿外泌體miR-29c表達量越高，MoCA評分越低，F(xiàn)A、VitB12水平越低，Hcy、CRP水平越高，認(rèn)知功能損傷越嚴(yán)重，提示血漿外泌體miR-29c表達水平與VCI危險因子及腦血管疾病引起的認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)。葉蓓等〔15〕發(fā)現(xiàn)miR-29c低表達能夠減輕大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)損傷，具有明顯的神經(jīng)保護功能，miR-29c表達升高，抑制神經(jīng)細(xì)胞遷移，損傷神經(jīng)功能，造成認(rèn)知功能障礙。VCI血漿外泌體miR-29c表達升高和血清Hcy、CRP、FA、VitB12水平異常，均會造成認(rèn)知功能障礙，兩者存在顯著相關(guān)性。因此，miR-29c具有作為VCI診斷候選生物標(biāo)志物的潛能。