陳 涔，李園園，潘頻華，胡成平，楊華平

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院呼吸內(nèi)科 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 國家臨床重點(diǎn)?？?國家呼吸疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心核心單位，湖南 長沙 410008)

社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumonia, CAP)是常見的呼吸道疾病之一，人群普遍易感，重癥患者表現(xiàn)為以呼吸衰竭為主的多臟器功能損傷，危及生命。研究[1-4]表明，CAP的病死率與患者病情嚴(yán)重程度相關(guān)，重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)中重癥CAP患者病死率達(dá)23%～47%。由于CAP病原菌構(gòu)成復(fù)雜，新發(fā)、未知、耐藥病原體層出不窮，使抗感染治療的難度日益加大，造成巨大的醫(yī)患壓力。及時(shí)、正確的抗感染治療是成功救治重癥CAP的關(guān)鍵。在經(jīng)驗(yàn)治療效果不佳，致病病原體不明，常規(guī)微生物檢測方法無陽性提示的情況下，如何快速、準(zhǔn)確找到致病病原體，給予敏感的抗菌藥物進(jìn)行精準(zhǔn)治療，改善不良預(yù)后，是臨床醫(yī)生的迫切愿望。目前，常用的肺炎病原學(xué)檢測方法，如形態(tài)學(xué)檢查(涂片、透射電鏡)、分離培養(yǎng)、免疫學(xué)方法各有優(yōu)勢，但對于重癥感染病例，傳統(tǒng)方法在檢測時(shí)間、陽性率和特異性方面存在局限性。

二代測序技術(shù)(next-generation sequencing，NGS)又稱下一代測序技術(shù)、高通量測序技術(shù)，以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定和一般讀長較短等為標(biāo)志。宏基因組二代測序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)不基于培養(yǎng)，直接從臨床標(biāo)本中提取全部微生物的DNA。mNGS技術(shù)被廣泛應(yīng)用于探究疑難感染病的病原體。本文回顧本科呼吸ICU成功救治的3例重癥CAP病例，分析基于mNGS技術(shù)在患者病原學(xué)診斷中的價(jià)值，同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)和自身工作經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)該技術(shù)合理使用的基本步驟和臨床意義。

1 病歷資料

1.1 病例1 患者男性，40歲，既往體健。因“咳嗽、發(fā)熱8 d，呼吸困難2 d，加重伴意識(shí)障礙1 d”經(jīng)外院轉(zhuǎn)入。體溫最高39.5℃，咳少量黃膿痰，伴頭痛、頭暈、胸悶、四肢酸痛。外院CT提示右下肺實(shí)變，考慮CAP，予以阿莫西林0.5 g bid口服抗感染治療，患者癥狀加重，復(fù)查CT示，雙肺病變進(jìn)展(圖1治療前)，后逐漸出現(xiàn)呼吸困難、意識(shí)模糊、休克。予以氣管插管接有創(chuàng)呼吸機(jī)輔助通氣、抗休克治療，同時(shí)改抗感染藥物為奧司他韋75 mg q12h口服,聯(lián)合美羅培南0.5 g q8h靜滴。因病情危重，次日轉(zhuǎn)入我院呼吸ICU。入院體格檢查：T 39.5℃，P 114次/分，R 25次/分(有創(chuàng)呼吸機(jī)輔助通氣，PCV模式，氧濃度70%)， BP 80/60 mmHg(去甲腎上腺素0.6 μg/Kg·min靜脈泵入升壓)，SPO293%。鎮(zhèn)靜狀態(tài)，雙肺呼吸音粗，右肺聞及濕啰音。血?dú)夥治鎏崾荆琁型呼吸衰竭。血常規(guī)：白細(xì)胞10.4×109/L，中性粒細(xì)胞9.8×109/L，淋巴細(xì)胞0.6×109/L，血小板72×109/L；降鈣素原：32.5 ng/mL。心肌酶學(xué)輕度升高，呼吸道九聯(lián)檢(ELISA法檢測支原體、衣原體、軍團(tuán)菌、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、型流感病毒抗體IgM)、病毒全套(抗體IgM檢測：巨細(xì)胞病毒采用化學(xué)發(fā)光法檢測，EB病病毒、柯薩奇病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、單純皰疹病毒采用ELISA法檢測)、鼻拭子甲乙型流感病毒抗原檢測均陰性，結(jié)締組織疾病相關(guān)檢查陰性。入院診斷：(1)重癥CAP、I型呼吸衰竭；(2)膿毒癥、膿毒癥休克。予以美羅培南1 g q8h靜滴，聯(lián)合替加環(huán)素50 mg q12h靜滴，經(jīng)驗(yàn)性廣覆蓋抗感染治療。行床旁支氣管鏡留取右下葉支氣管分泌物送細(xì)菌+真菌涂片及培養(yǎng)，留取BALF送檢mNGS。下呼吸道分泌物涂片提示革蘭陽性菌，2 d后mNGS結(jié)果提示為肺炎鏈球菌(見圖2、表1)，后續(xù)細(xì)菌、真菌培養(yǎng)無陽性結(jié)果?？紤]患者發(fā)病已10 d，前期廣覆蓋抗感染效果不佳，致病的鏈球菌可能為多重耐藥菌，遂調(diào)整抗菌藥物為利奈唑胺0.6 g q12h靜滴，聯(lián)合左氧氟沙星0.5 g qd靜滴。治療1周后血常規(guī)、降鈣素原逐漸恢復(fù)正常，氧合指數(shù)好轉(zhuǎn)，拔管撤機(jī)，好轉(zhuǎn)出院。出院后口服左氧氟沙星0.5 g qd，1周后復(fù)查，肺部病變明顯吸收(圖1治療后)。

圖1 病例1治療前后肺CT對比圖

Figure 1 Lung CT imaging finding of case 1 before and after therapy

圖2 病例1二代測序示沿肺炎鏈球菌基因組分布的核苷酸序列

Figure 2 mNGS result of nucleotide sequences distributed along the genome ofStreptococcuspneumoniaeof case 1

表1 病例1二代測序結(jié)果

1.2 病例2 患者男性，49歲，既往體健。因“發(fā)熱10 d，咳嗽、咳痰5 d，加重并呼吸困難2 d”由外院轉(zhuǎn)入本院呼吸ICU。體溫最高40.0℃，伴畏寒、寒戰(zhàn)、全身肌肉酸痛，咳少量黃痰。外院胸片提示雙下肺感染，考慮CAP，予以奧司他韋聯(lián)合莫西沙星抗感染治療，患者癥狀無緩解，持續(xù)高熱，且出現(xiàn)進(jìn)行性呼吸困難，血?dú)夥治鎏崾綢型呼吸衰竭。因氧合持續(xù)下降，無創(chuàng)輔助通氣無效，同時(shí)出現(xiàn)休克，遂改為氣管插管接有創(chuàng)呼吸機(jī)輔助通氣。入院體格檢查：T 39.2℃，P 106 次/分，R 35次/分，BP 93/58 mmHg，SPO291% (有創(chuàng)呼吸機(jī)輔助通氣，PCV模式，氧濃度80%)，雙側(cè)球結(jié)膜顯著充血。雙肺聞及散在啰音。血?dú)夥治鎏崾綢型呼吸衰竭。入院診斷:重癥CAP、急性呼吸窘迫綜合征、多器官功能障礙綜合征。予以亞胺培南/西司他丁0.5 g q6h靜滴，聯(lián)合奧司他韋150 mg q12h口服,更昔洛韋0.3 g q12h靜滴，經(jīng)驗(yàn)性抗細(xì)菌和病毒治療。當(dāng)日即予以床旁支氣管鏡下留取右下葉支氣管分泌物送細(xì)菌+真菌涂片及培養(yǎng)，留取支氣管肺泡灌洗液(BALF)送檢mNGS。同時(shí)完善其他檢查，結(jié)果先后回報(bào)示：白細(xì)胞4.5×109/L，中性粒細(xì)胞4.0×109/L，淋巴細(xì)胞0.5×109/L，血小板74×109/L。降鈣素原：0.4 ng/mL。心肌酶學(xué)：乳酸脫氫酶433 U/L，肌酸激酶372 U/L，肌紅蛋白216.6 μg/L，均明顯增高，呼吸道九聯(lián)檢、病毒全套、鼻拭子甲乙型流感抗原檢測均陰性，結(jié)締組織疾病相關(guān)檢查陰性。復(fù)查肺部CT提示雙下肺大面積實(shí)變(見圖3治療前)。2 d后結(jié)果回報(bào)為腺病毒7型感染(見圖4)，人 類 腺 病 毒7型覆蓋率為98.21%，深度為14.51，序列數(shù)為467。因該病毒尚缺乏特異性治療藥物，遂停用前述抗病毒藥物，保留亞胺培南/西司他丁抗繼發(fā)細(xì)菌感染，予以大劑量丙種球蛋白靜滴和強(qiáng)有力的支持治療，后體溫、心肌酶學(xué)指標(biāo)逐漸正常，缺氧逐漸改善，復(fù)查影像學(xué)雙下肺實(shí)變部分吸收。1周后予以拔管撤機(jī)，病情穩(wěn)定出院。出院后隨訪2個(gè)月，雙肺病變基本吸收(見圖3治療后)。

Figure 3 Lung CT imaging finding of case 2 before and after therapy

Figure 4 mNGS result of nucleotide sequences distributed along the genome of adenovirus type 7

1.3 病例3 患者女性，51歲，因“發(fā)熱、咳嗽13 d，進(jìn)行性呼吸困難10 d”轉(zhuǎn)入本院呼吸ICU。體溫最高達(dá)40.2℃，咳少量黃白痰，無畏寒、寒戰(zhàn)。入院前外院查肺部CT，提示右下葉實(shí)變并少量胸腔積液，診斷CAP，先后予以頭孢美唑、依替米星、亞胺培南/西司他丁、萬古霉素抗感染治療，癥狀逐漸加重。既往診斷甲狀腺功能減退癥，近期有家禽接觸史。入院體格檢查：T 38.8℃，P 107次/分， R 23次/分，BP 118/77 mmHg，SPO293% (鼻導(dǎo)管給氧，氧濃度45%)，血?dú)夥治鎏崾綢型呼吸衰竭，呼吸性堿中毒。入院診斷：(1)重癥CAP、I型呼吸衰竭、呼吸性堿中毒；(2)甲狀腺功能減退癥；(3)中度貧血(原因待查)。入院后完善抽血檢查，同時(shí)予以床旁支氣管鏡下留取右下葉分泌物送檢細(xì)菌真菌涂片及培養(yǎng)，留取BALF送檢mNGS，同時(shí)予以經(jīng)鼻高流量氧療改善氧合。經(jīng)驗(yàn)性給予莫西沙星0.4 g qd靜滴抗細(xì)菌和非典型病原體，奧司他韋75 mg q12h口服抗病毒治療。結(jié)果回報(bào)血常規(guī)：白細(xì)胞6.16×109/L，中性粒細(xì)胞5.34×109/L，淋巴細(xì)胞0.67×109/L，血紅蛋白73 g/L。降鈣素原1.83 ng/mL。呼吸道九聯(lián)檢：肺炎衣原體抗體IgM陽性，余陰性；病毒全套檢測、鼻拭子甲乙流感抗原檢測、結(jié)締組織疾病相關(guān)檢查均陰性。復(fù)查肺部CT提示，雙肺大面積實(shí)變，范圍較前明顯進(jìn)展(見圖5治療前)，雙側(cè)少量胸腔積液。mNGS結(jié)果回報(bào)為鸚鵡熱衣原體感染(見圖6)，鸚 鵡 熱 衣 原 體覆蓋率為4.15%，深度為1.02，序列數(shù)為216。停用抗病毒藥物，予以多西環(huán)素0.1 g q12h，聯(lián)合莫西沙星靜滴抗鸚鵡熱衣原體治療，2 d后體溫恢復(fù)正常，I型呼吸衰竭逐漸糾正。治療10 d后復(fù)查肺部CT較前病變明顯吸收，予以出院并囑米諾環(huán)素0.1 g q12h口服1周。1個(gè)月后隨訪，肺部CT基本正常(圖5治療后)。

Figure 5 Lung CT imaging finding of case 3 before and after therapy

圖6 二代測序示沿鸚鵡熱衣原體基因組分布的核苷酸序列

Figure 6 mNGS result of nucleotide sequences distributed along the genome ofChlamydiapsittaci

2 討論

mNGS利用基因組學(xué)的研究策略，研究樣品所包含的全部微生物的遺傳組成及其群落功能，具有病原體陽性檢出率高、快速等特點(diǎn)，此外還有如下優(yōu)勢：無偏倚；病原體廣覆蓋，靈敏度高；可深入提供病原體鑒定、分型、耐藥基因和毒力因子分析；以序列為基礎(chǔ)，可檢測新發(fā)病原體，并進(jìn)行溯源分類[5]。mNGS和常用的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)等方法最大的區(qū)別就是前者是“非靶向”，即對送檢標(biāo)本中所存在的病原微生物“一網(wǎng)打盡”，化“未知為已知”。而傳統(tǒng)方法首先需要臨床醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)，有針對性的選擇一對一的病原檢測項(xiàng)目，即“佐證經(jīng)驗(yàn)診斷”，相對局限。研究發(fā)現(xiàn)mNGS對免疫抑制宿主感染的病原體診斷具有重要的參考價(jià)值，在病毒和細(xì)菌診斷方面與傳統(tǒng)方法相比，陽性率高出3倍以上，且具有更高的陰性預(yù)測值[6]，故mNGS技術(shù)被廣泛應(yīng)用于探究疑難感染病的病原體。2014年《新英格蘭雜志》Wilson等[7]報(bào)道利用mNGS方法檢測出腦脊液中鉤端螺旋體，從而挽救一例不明原因腦積水8個(gè)月、先后使用38項(xiàng)感染病原檢測且使用5種抗菌藥物無效的聯(lián)合免疫缺陷患兒的生命。其后對該病例的述評中，mNGS技術(shù)被提升到了“改變世界”的高度。程軍等[8]研究表明，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，mNGS 檢測感染性心內(nèi)膜炎瓣膜贅生物的靈敏度更高，時(shí)間短,對培養(yǎng)陰性的疑似感染性心內(nèi)膜炎的診斷和治療有較大的應(yīng)用價(jià)值。本科前期收治的不明原因重癥肺炎病例,應(yīng)用BALF行mNGS檢測,快速診斷重癥恙蟲病立克次體感染后改用多西環(huán)素，成功救治患者[9]。NGS適用于常規(guī)檢測結(jié)果為陰性的不明原因感染患者，對提高疾病診斷，特別是危重患者的診斷有很大的幫助[10]，對類似本文中初始治療失敗的急危重癥患者尤其適用。以上3例CAP病例均為免疫正常人群，起病急，迅速出現(xiàn)呼吸衰竭、循環(huán)衰竭，演變?yōu)橹匕Y肺炎，危及生命。但從流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)等方面并沒有明顯特征性，經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療存在難度且效果不佳。病例1因早期使用廣譜抗菌藥物，常規(guī)下呼吸道分泌物培養(yǎng)即使為常見的鏈球菌也難以有陽性結(jié)果；病例2腺病毒感染未列入常規(guī)的血清學(xué)檢查；病例3血清衣原體抗體IgM雖呈陽性，但此抗體在人體中存在時(shí)間1～3個(gè)月不等，故不能判斷是否為現(xiàn)癥感染，且不能明確其具體類型。通過同時(shí)送檢BALF行mNGS檢測，明確致病微生物，調(diào)整治療方案，針對性使用抗感染藥物，患者癥狀很快緩解，影像學(xué)顯示病變吸收，達(dá)到臨床治愈，效果優(yōu)于經(jīng)驗(yàn)性的“廣覆蓋”治療。對BALF進(jìn)行mNGS檢測在上述患者的診斷中起到關(guān)鍵性的作用，敏感性高，確診時(shí)間快，尤其在經(jīng)典常規(guī)方法所不能檢測的病原菌方面有獨(dú)特優(yōu)勢，避免了長期過廣、過多的使用抗菌藥物[5]，實(shí)現(xiàn)從“精準(zhǔn)診斷”到“精準(zhǔn)治療”，從而縮短病程，提高救治成功率。mNGS技術(shù)為呼吸道微生物檢測帶來了重大變革,能同時(shí)測定多種病原體的保守基因序列,使對呼吸道微生物群落的研究達(dá)到前所未有的廣度和深度[11]。研究[12]顯示，通過mNGS早期明確診斷后，臨床依據(jù)結(jié)果調(diào)整患者治療方案，患者28、90 d生存率均有提高，90 d生存率從57.7%提高至83.3%。

2018版《中國成人醫(yī)院獲得性肺炎與呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎診斷和治療指南》[13]對于mNGS的送檢要求做了很好的詮釋：審慎送檢、規(guī)范流程、合理解讀。筆者根據(jù)自身工作經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合國內(nèi)外專家共識(shí)、專題講座和專業(yè)文獻(xiàn)等，將其流程概括如下，旨在幫助臨床更好地開展mNGS檢測工作。第一步：選擇合適的病例和送檢時(shí)機(jī)。2019年2月《宏基因組分析和診斷技術(shù)在急危重癥感染應(yīng)用的專家共識(shí)》[14]明確指出，mNGS在急危重癥感染患者使用中的主要適應(yīng)證包括：(1)病情危重需要盡快明確病原體；(2)特殊患者，如免疫抑制宿主，合并基礎(chǔ)疾病，反復(fù)住院的重癥感染者，需盡快明確病原體；(3)傳統(tǒng)微生物檢測技術(shù)反復(fù)陰性且治療效果不佳；(4)疑似新發(fā)病原體，臨床上提示可能有一定的傳染性；(5)疑似特殊病原體感染；(6)長期發(fā)熱和/或伴有其他臨床癥狀、病因不明的感染。可將其概括為六字原則：“疑難、危重、特殊”。指南強(qiáng)調(diào)，以上情況盡快送檢。第二步：選取合適的標(biāo)本送檢。對于單純肺炎患者，選擇經(jīng)支氣管鏡操作采集的BALF標(biāo)本，優(yōu)于痰和血標(biāo)本，或有條件時(shí)選擇感染部位的穿刺組織標(biāo)本，可減少上呼吸道和口腔定植菌的污染。對于合并膿毒癥、血流感染的患者，可同時(shí)送檢血清標(biāo)本，提高陽性率。如考慮合并其他部位或器官感染，建議同時(shí)送檢感染部位的標(biāo)本，如合并顱內(nèi)感染送檢腦脊液、胸腔感染送檢胸腔積液等。同時(shí)嚴(yán)格按照送檢要求取材、處理和及時(shí)送檢，選擇有資質(zhì)的機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測。以上操作將極大程度提高檢測的陽性率和準(zhǔn)確性。第三步：結(jié)合臨床合理解讀報(bào)告。mNGS的特點(diǎn)是將標(biāo)本中的微生物“一網(wǎng)打盡”，但非“一錘定音”。呼吸道非無菌腔道，定植菌多[15]，檢測報(bào)告解讀相對復(fù)雜。如果是嚴(yán)格致病病原體，如結(jié)核分枝桿菌、諾卡菌、流感病毒、曲霉菌等，可考慮為致病菌。若是條件致病菌，如銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌等，要結(jié)合序列數(shù)判定是否為致病菌。常見的口腔雜菌、呼吸道定植菌一般不考慮為致病菌，除非序列數(shù)特別高，尤其患者有吸入因素、肺部病變考慮出現(xiàn)肺膿腫時(shí)，要考慮為致病菌。病例1鏈球菌序列數(shù)明顯高于其他幾種細(xì)菌，以此鑒別致病菌和定植菌。若是罕見、特殊病原體，需要具體分析。病例2中的人類腺病毒7型和病例3中的鸚鵡熱衣原體，二者均有較高的序列，同時(shí)結(jié)合流行病學(xué)和臨床特點(diǎn)，考慮為致病菌?？傊R床醫(yī)生需要緊密結(jié)合患者的臨床特征和其他診斷資料，選擇最可能、最符合臨床實(shí)際的結(jié)果。

目前，mNGS也存在局限性，mNGS檢測要求技術(shù)水平較高，存在去人源化難度大，對RNA病毒檢出率低，真菌和結(jié)核菌提取DNA相對困難等問題；缺乏統(tǒng)一、完善的檢測流程和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)[16]；結(jié)果無法區(qū)分定植菌和致病菌，暫時(shí)還無法同時(shí)得到抗菌藥物藥敏結(jié)果，檢測費(fèi)用較高等。臨床醫(yī)生拿到mNGS檢測結(jié)果時(shí)，應(yīng)以患者為中心，結(jié)合病例臨床特點(diǎn)和其他檢驗(yàn)結(jié)果綜合分析[16]，動(dòng)態(tài)觀察療效，真正做到“精準(zhǔn)”診療，讓患者獲益，最大程度地改善患者預(yù)后。在遇到疑難、危重、復(fù)雜的肺部感染時(shí)，可盡早將mNGS與其他檢測平行送檢，讓mNGS技術(shù)和其他病原體檢測手段一起形成“快速診斷體系”， 作為感染病原體診斷的重要組成和補(bǔ)充。