侯憲文，符瑞益，徐 林，文少白

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所/海南省熱帶生態(tài)循環(huán)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?海南 571101；2.海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，海口 海南 571199）

【研究意義】姬松茸（Agaricus blazeiMurill）又稱(chēng)巴西蘑菇、柏氏蘑菇和小松菇。屬于擔(dān)子菌亞門(mén)層菌綱傘菌目蘑菇科蘑菇屬［1］。姬松茸口感脆嫩，營(yíng)養(yǎng)豐富，含有活性多糖體、蛋白質(zhì)、維生素B1、維生素B2、煙堿酸等，具有增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能、降血糖、降血脂、調(diào)節(jié)血壓、改善肝功能、抗過(guò)敏反應(yīng)等功效［2］。因此，姬松茸作為一種珍稀的食藥兼用真菌，在食品加工、醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域具有廣闊的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景［3］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】傳統(tǒng)的姬松茸培養(yǎng)采用固體栽培法，但其對(duì)于固體栽培的環(huán)境條件要求嚴(yán)格，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，子實(shí)體產(chǎn)量低且不穩(wěn)定，易受氣候變化的影響。采用液體發(fā)酵培養(yǎng)姬松茸菌絲體，則可把生產(chǎn)周期縮短到15 d內(nèi)，而且生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便，培養(yǎng)材料易得，產(chǎn)品質(zhì)量易于控制，生產(chǎn)成本大幅度下降［4］。鄒祥等研究表明，在初始pH 5.5、250 mL搖瓶裝液量50 mL、接種量15%、溫度26℃的培養(yǎng)條件下，姬松茸深層發(fā)酵結(jié)果最佳，胞外多糖最高可達(dá) 3.48 g/L，搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)測(cè)定，姬松茸適宜發(fā)酵周期為108 h［5］。劉冬華等研究發(fā)現(xiàn)，在葡萄糖2.5%、玉米淀粉2.0%、麥芽粉1.2%、豆餅粉1.2%、硫酸鎂0.1%、磷酸二氫鉀0.3%，采用500 mL錐形瓶，pH自然、裝量80 mL、培養(yǎng)溫度25℃、轉(zhuǎn)速200 r/min的條件下培養(yǎng)10 d，姬松茸發(fā)酵培養(yǎng)情況最佳，胞內(nèi)多糖產(chǎn)量達(dá)到7.028 mg/mL［6］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，關(guān)于姬松茸液體發(fā)酵的研究主要通過(guò)評(píng)價(jià)發(fā)酵后的胞多糖產(chǎn)量，且研究大多集中在對(duì)碳源、氮源、碳氮比、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子和 pH值等條件的單因素優(yōu)化上。在實(shí)際發(fā)酵培養(yǎng)中，單因素之間是相互影響的，因此研究姬松茸液體發(fā)酵的多因素影響，對(duì)摸索姬松茸液體發(fā)酵的最適條件具有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究擬對(duì)姬松茸液體發(fā)酵過(guò)程中的碳源、氮源、pH值以及無(wú)機(jī)鹽等發(fā)酵條件進(jìn)行單因子優(yōu)化，根據(jù)單因子發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行正交組合實(shí)驗(yàn)，以姬松茸發(fā)酵后菌絲量的干重為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定姬松茸液體發(fā)酵最佳條件，為姬松茸進(jìn)一步深層發(fā)酵和應(yīng)用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

姬松茸菌（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所保存的菌種IPPI-ABM-03），菌種以菌棒保存，實(shí)驗(yàn)中將菌棒中的菌接種到PDA固體斜面培養(yǎng)基上純化，擴(kuò)繁。

PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水1 000 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 姬松茸液體培養(yǎng) 從純化、擴(kuò)繁的姬松茸菌株固體斜面取菌，將其接種至PDA固體平板培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)5 d，隨后用無(wú)菌打孔器（直徑0.5 cm）從長(zhǎng)滿(mǎn)菌絲體的平皿培養(yǎng)基上取菌種塊，接種至裝有100 mL滅菌液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，25℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)5 d后，測(cè)定菌絲體生物量。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行樣。

1.2.2 菌絲體生物量（菌絲體干重）的測(cè)定將發(fā)酵液用烘干至恒重的孔徑為0.15 mm銅網(wǎng)過(guò)濾，濾網(wǎng)上的菌絲團(tuán)經(jīng)去離子水沖洗3～5遍，隨后將銅網(wǎng)和菌絲體置于烘箱中，60℃烘干至恒重，冷卻后稱(chēng)重，記為M1，過(guò)濾前烘干至恒重的銅絲網(wǎng)質(zhì)量記為M0，則液體發(fā)酵后菌絲體干重為M1-M0。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) （1）不同碳源對(duì)姬松茸菌絲量的影響。將PDA培養(yǎng)基中的葡萄糖分別更換成相同質(zhì)量的羧甲基纖維素鈉（CMC）、甘露醇、可溶性淀粉和蔗糖，配置成不同碳源的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，考察不同碳源下姬松茸的菌絲生長(zhǎng)情況。（2）不同氮源對(duì)姬松茸菌絲量的影響。每100 mL液體PDA培養(yǎng)基中分別加入0.3 g的氯化銨、硫酸銨和硝酸鉀，配置不同氮源發(fā)酵培養(yǎng)基，考察不同氮源下姬松茸的菌絲生長(zhǎng)情況。（3）不同pH值對(duì)姬松茸菌絲量的影響。用0.1 mol/L鹽酸和0.1 mol/L氫氧化鈉分別將PDA液體培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，以自然條件的PDA液體培養(yǎng)基為對(duì)照，考察不同pH值下姬松茸的菌絲生長(zhǎng)情況。（4）其他營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)姬松茸菌絲量的影響。在100 mL液體PDA培養(yǎng)基中分別加入0.05 g維生素B2、硫酸鎂、氯化鉀、磷酸二氫鈉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，考察添加不同營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)姬松茸菌絲生長(zhǎng)的影響。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)不同碳源種類(lèi)（葡萄糖、甘露醇、可溶性淀粉）、氮源（氯化銨、硫酸銨、硝酸鉀）、pH（5.0、5.5、6.0）、其他營(yíng)養(yǎng)元素（硫酸鎂、氯化鉀、磷酸二氫鈉）進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基，選用正交表L9（34），以菌絲體生物量為考察指標(biāo)，詳見(jiàn)表1。

表 1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 Combination of factors in orthogonal test

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Excel 2013進(jìn)行處理統(tǒng)計(jì)，采用Origin 8.0進(jìn)行作圖處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對(duì)姬松茸菌絲量的影響

碳是構(gòu)成菌體細(xì)胞和發(fā)酵產(chǎn)物分子的主要骨架成分，常用的微生物碳源種類(lèi)很多，主要有無(wú)機(jī)碳化合物（CO2、CO32-）、碳?xì)浠衔铮淄椤⑹灒┘案鞣N碳水化合物（糖類(lèi)、淀粉、纖維素）等［7］。本試驗(yàn)分別以葡萄糖、CMC、甘露醇、可溶性淀粉、蔗糖為碳源，比較培養(yǎng)液中姬松茸的生物生長(zhǎng)量，結(jié)果見(jiàn)圖1。以甘露醇為碳源時(shí)，姬松茸菌絲干重最大、達(dá)到0.3427 g，葡萄糖和可溶性淀粉次之。因此，本試驗(yàn)選取甘露醇、葡萄糖和可溶性淀粉進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同碳源對(duì)姬松茸菌絲干重的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on dry weight of A.blazei mycelium

2.2 不同氮源對(duì)姬松茸菌絲量的影響

氮是微生物生長(zhǎng)不可缺少的營(yíng)養(yǎng)元素之一，其既是菌體的構(gòu)成元素，也是代謝產(chǎn)物中氮源的來(lái)源。本試驗(yàn)分別以氯化銨、硫酸銨、硝酸鉀為唯一氮源，以普通PDA液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，考察不同氮源下，姬松茸菌絲量生長(zhǎng)情況。結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)，添加不同氮源后，姬松茸菌絲量明顯高于空白對(duì)照，其中以硝酸鉀為外加氮源時(shí)效果最好，菌絲干重達(dá)到0.4718 g。后續(xù)研究選用氯化銨、硫酸銨、硝酸鉀進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同氮源對(duì)姬松茸菌絲干重的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources on dry weight of A.blazei mycelium

2.3 不同pH值對(duì)姬松茸菌絲量的影響

圖3 不同pH值對(duì)姬松茸菌絲干重的影響Fig.3 Effects of different pH on dry weight of A.blazei mycelium

有研究表明，姬松茸菌絲能在 pH值為3.5～9.5的基質(zhì)中生長(zhǎng)［8］。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了液體培養(yǎng)基的pH值范圍為5.0～7.0。從圖3可以看出，當(dāng)pH值為5.0～6.0時(shí)，姬松茸菌絲生長(zhǎng)最好。因此，后續(xù)研究選擇pH值為5.0、5.5、6.0進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.4 其他營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)姬松茸菌絲量的影響

除基本的碳源、氮源外，姬松茸菌絲的生長(zhǎng)還需要一些礦質(zhì)元素和其他營(yíng)養(yǎng)元素［9］。本試驗(yàn)營(yíng)養(yǎng)元素的添加對(duì)姬松茸菌絲生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用（圖4），其菌絲干重明顯高于對(duì)照，其中硫酸鎂、氯化鉀、磷酸二氫鈉的效果優(yōu)于維生素B2，后續(xù)研究選取硫酸鎂、氯化鉀、磷酸二氫鈉進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖4 其他營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)姬松茸菌絲干重的影響Fig.4 Effects of other nutrients on dry weight of A.blazei mycelium

2.5 液體發(fā)酵培養(yǎng)基及條件優(yōu)化

根據(jù)液體發(fā)酵培養(yǎng)基的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析（表2）可知，本試驗(yàn)各因素對(duì)姬松茸菌絲產(chǎn)量的影響由大到小依次為碳源、營(yíng)養(yǎng)元素、pH值和氮源，最佳因素水平組合為A1B2C3D3。根據(jù)姬松茸液體發(fā)酵培養(yǎng)最佳條件進(jìn)行3次平行培養(yǎng)試驗(yàn)，姬松茸菌絲干重為0.4463±0.0132 g。確定的最佳培養(yǎng)條件與正交實(shí)驗(yàn)中的產(chǎn)量最高組合接近，且重復(fù)性良好，從而可以確定姬松茸液體發(fā)酵培養(yǎng)條件：葡萄糖為碳源、硫酸銨為氮源、磷酸二氫鈉為其他營(yíng)養(yǎng)元素，液體初始pH值為6.0。

表 2 正交組合結(jié)果及極差分析Table 2 Orthogonal combination results and range analysis

3 討論

食用菌液體發(fā)酵培養(yǎng)是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，影響菌絲生長(zhǎng)的因素很多，主要有碳源、氮源、溫度、pH值、無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)元素［10］。陳博文等研究繡球菌的液體發(fā)酵工藝條件表明，以葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源時(shí)對(duì)菌絲的生長(zhǎng)速率和胞外多糖產(chǎn)量影響最大［11］；張學(xué)秋等研究表明，以蔗糖為碳源、牛肉膏和酵母膏（質(zhì)量比1∶1）作為復(fù)合氮源時(shí)，蟬擬青霉多糖含量和菌體干重均最高［12］。因此，不同種類(lèi)真菌對(duì)碳源、氮源的要求不同［13-14］。本研究中，姬松茸在單因子發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，以甘露醇為外加碳源時(shí)，姬松茸菌絲量最大，其次為淀粉、葡萄糖和蔗糖。而在研究外加氮源的影響時(shí)，添加硝酸銨時(shí)姬松茸菌絲量最大，其次為硫酸銨和氯化銨，與前人研究結(jié)果存在差別。但前人研究選擇的碳、氮源大多為純天然來(lái)源的有機(jī)碳源和氮源，成分較為復(fù)雜，而本研究主要選擇結(jié)構(gòu)確定的化合物作為碳、氮源，因此與前人結(jié)果存在差異。

在食用菌的液體培養(yǎng)中，pH 值是重要的影響因素之一［15］?？盗种サ龋?6］以菌絲體生物量為檢測(cè)指標(biāo)對(duì)金耳液體發(fā)酵條件進(jìn)行研究，結(jié)果表明金耳菌在pH值為3.0～6.0的條件下均能生長(zhǎng)，且pH值為5.0時(shí)菌絲量達(dá)到最大。劉青娥對(duì)褐環(huán)粘蓋牛肝菌進(jìn)行液體發(fā)酵條件研究考察其產(chǎn)多糖的能力，結(jié)果表明pH值在5.6時(shí)產(chǎn)糖量最大［10］。本研究中姬松茸在pH值為5.0時(shí)，菌絲量產(chǎn)量最高，這與前人結(jié)果基本一致，食用真菌在偏酸性環(huán)境中生長(zhǎng)較好。

此外，礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素也是微生物生長(zhǎng)必不可少的成分，對(duì)真菌生長(zhǎng)、代謝物的合成和分泌有十分重要的作用［17］。VB1和VB2對(duì)桑黃菌絲體發(fā)酵生長(zhǎng)有著不同的促進(jìn)作用，并具有協(xié)同效應(yīng)。在PDA培養(yǎng)基中分別添加0.3 g/L VB1和VB2進(jìn)行發(fā)酵，菌絲體產(chǎn)量提高，且多糖產(chǎn)量也提高［18］。本研究選用的4種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)均能提高姬松茸的菌絲產(chǎn)量，磷酸二氫鈉效果最好，且3種無(wú)機(jī)鹽的效果均優(yōu)于維生素B1，這可能是無(wú)機(jī)鹽在發(fā)酵過(guò)程中起到調(diào)節(jié)滲透壓、氧化還原電位等作用，添加少量無(wú)機(jī)鹽能促進(jìn)菌絲體的生長(zhǎng)。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了姬松茸液體發(fā)酵培養(yǎng)的碳源、氮源、pH值和其他營(yíng)養(yǎng)元素，得到其最優(yōu)組合，即在25℃條件下，以葡萄糖為碳源、硫酸銨為氮源、磷酸二氫鈉為其他營(yíng)養(yǎng)元素，液體初始pH值為6，培養(yǎng)5 d，100 mL發(fā)酵液中姬松茸菌絲干重為0.4463（±0.0132）g。本研究探索的姬松茸液體發(fā)酵條件，能實(shí)現(xiàn)姬松茸菌絲的快速生長(zhǎng)，提高姬松茸菌絲生長(zhǎng)量。相對(duì)于固體培養(yǎng)，時(shí)間更短，菌株發(fā)育更快，為進(jìn)一步發(fā)酵提取姬松茸胞外多糖、實(shí)現(xiàn)其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)、擴(kuò)大發(fā)酵培養(yǎng)提供技術(shù)支持。