何 梅，章金輝，王再花，李 杰，葉廣英，葉慶生

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所/廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；2.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510631）

【研究意義】CO2施肥技術(shù)是實(shí)現(xiàn)人工栽培溫室植物高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的重要手段之一，隨著設(shè)施栽培產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，設(shè)施內(nèi)CO2施肥作為一項(xiàng)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、抗病的技術(shù)手段越來越受到人們的關(guān)注。鐵皮石斛（Dendrobium officinale）作為我國傳統(tǒng)名貴中藥材，其人工繁育和栽培技術(shù)不斷成熟，但品質(zhì)和產(chǎn)量仍參差不齊。CO2作為植物光合作用的原料，研究CO2施肥情況下鐵皮石斛的光合特性、生長(zhǎng)和有效成分的變化，對(duì)促進(jìn)鐵皮石斛生長(zhǎng)與改良其產(chǎn)量與品質(zhì)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】鐵皮石斛是蘭科石斛屬多年生草本附生植物，以莖入藥，具有滋陰清熱、益胃生津等功效，富含多糖、氨基酸、菲類、聯(lián)芐類等70余種化合物，具有抗腫瘤、抗氧化和增強(qiáng)免疫力等作用［1-2］。鐵皮石斛的弱光適應(yīng)能力較強(qiáng)，具有明顯的陰生植物特征［3］，但鐵皮石斛對(duì)環(huán)境中CO2的要求較高，CO2補(bǔ)償點(diǎn)和CO2飽和點(diǎn)都比較高［4］。大量研究表明，增加CO2濃度可顯著提高葡萄、大豆、水稻、小麥等植物的生物量和產(chǎn)量［5-7］，也能促進(jìn)番茄果實(shí)、黃瓜、甜瓜中可溶性糖和淀粉的積累［8-10］。劉漢峰等［11］曾報(bào)道CO2濃度倍增能提高鼓槌石斛和金釵石斛的日均凈光合速率和水分利用效率。Cho等［12］也發(fā)現(xiàn)增加CO2濃度能提高蝴蝶蘭品種的開花質(zhì)量，但高CO2濃度下鐵皮石斛等蘭科藥用植物生長(zhǎng)、有效成分和產(chǎn)量變化尚不清楚。

【本研究切入點(diǎn)】近年來，鐵皮石斛在我國的種植范圍迅速擴(kuò)大，主要以大棚栽培和仿野生栽培為主，種植面積已超過6 700 hm2，產(chǎn)業(yè)規(guī)模達(dá)百億元［13］，但有關(guān)鐵皮石斛栽培中CO2處理的研究還鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究參考前人在鼓槌石斛、蝴蝶蘭和非洲菊上等植物上報(bào)道的CO2濃度（800 μmol/mol）［11-12,14］，通過倍增鐵皮石斛栽培環(huán)境中的CO2濃度，評(píng)估鐵皮石斛光合特性的動(dòng)態(tài)變化，以及處理180 d后鐵皮石斛生長(zhǎng)、有效成分和產(chǎn)量的變化，為提高其產(chǎn)量與品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采用秋季分蘗的鐵皮石斛（D.officinale）秋芽為試驗(yàn)材料，株高4～5 cm，單株葉片數(shù)4～5片，長(zhǎng)勢(shì)良好，玻璃溫室中栽培1個(gè)月。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2016年5月1日至10月25日（處理時(shí)間共180 d）在廣州華南師范大學(xué)蘭花研究中心進(jìn)行，玻璃溫室頂端覆蓋遮陽網(wǎng)（遮陽率75%），環(huán)境溫度24（± 1）℃，相對(duì)濕度80%左右。栽培基質(zhì)為樹皮∶木炭∶小石子∶紅磚細(xì)石 =4∶2∶1∶1，環(huán)境因子由浙江求是公司記錄儀實(shí)時(shí)監(jiān)控并記錄（每隔0.5 h記錄1次）。溫室內(nèi)CO2由鋼瓶供給（純度95%，廣州氣體廠提供）。選取長(zhǎng)勢(shì)一致的鐵皮石斛苗，參考前人報(bào)道的最佳CO2處理濃度［11-12,14］，每天7:00—17:00進(jìn)行CO2倍增處理，CO2濃度為倍增的大氣CO2濃度800（±50）μmol/mol，以大氣CO2濃度400（±50）μmol/mol作對(duì)照，每個(gè)處理45盆，3次重復(fù)。每盆每周施用200 mL 0.5 g/L德國進(jìn)口COMPO肥1次（N∶P2O5∶K2O = 30∶10∶10），每隔2 d澆水1次。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 葉片光合指標(biāo) 分別于處理后0、10、20、30、60、90、120、150、180 d隨機(jī)取長(zhǎng)勢(shì)健康的第4片完全展開的功能葉（從植株頂端往下數(shù)）進(jìn)行光合、形態(tài)及各項(xiàng)生理生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定，上午9:30—11:00，利用LI-6400便攜式光合測(cè)定儀（北京力高泰科技有限公司）分別測(cè)定CO2處理和對(duì)照的鐵皮石斛功能葉的光合指標(biāo)，包括凈光合速率（Pn）、細(xì)胞間隙CO2濃度（Ci）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、蒸騰速率（Tr）、水分利用效率（WUE）等，流速設(shè)定為500 mL/min。

1.3.2 生長(zhǎng)相關(guān)參數(shù) 處理180 d后隨機(jī)選取對(duì)照和CO2倍增處理植株各50株（5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10株），分別測(cè)定單株苗的莖高、莖粗（電子游標(biāo)卡尺測(cè)量）、葉片數(shù)、莖鮮質(zhì)量、莖干質(zhì)量（105 ℃殺青15 min，80 ℃烘至恒重）、單葉面積（杭州綠博YMJ-A葉面積儀測(cè)定）、比葉面積SLA（單葉面積/單葉干重）和葉片厚度（石蠟切片觀測(cè)，金華科迪KD-2260石蠟切片機(jī)）。

1.3.3 葉片可溶性蛋白含量 參考Bradford［15］的方法略加改進(jìn)。稱取0.1 g葉片剪碎于冷凍過的研缽中，加入1 mL磷酸緩沖液（pH 7.8）和少量石英砂，在冰浴中快速研磨成勻漿，勻漿倒入離心管中，再用4 mL的磷酸緩沖液將研缽中的勻漿洗入離心管中。在4 ℃、5 000 r/min條件下離心10 min，取上清液倒入10 mL的容量瓶中，殘?jiān)尤? mL磷酸緩沖液懸浮再離心，將上清液倒入容量瓶中混勻，定容至10 mL待測(cè)。取0.3 mL樣品提取液，加入0.7 mL磷酸緩沖液（pH 7.8），再加5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑顯色，搖勻，放置2 min，利用UV-2550 分光光度計(jì)測(cè)定595 nm吸光值。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 有效成分含量 鐵皮石斛莖的多糖含量測(cè)定參照《中華人民共和國藥典》（2015年版）中的苯酚－硫酸法［16］，總生物堿含量測(cè)定參照章金輝等［17］報(bào)道的方法，總黃酮含量測(cè)定參考Amri等［18］的方法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

總氨基酸含量測(cè)定參考魯芹飛［19］的方法稍作改進(jìn)：取0.3 g干燥的鐵皮石斛莖段粉末，置于具塞試管中，加入6 mol/L鹽酸10 mL，110 ℃烘箱中水解24 h，冷卻過濾，濾液移至25 mL容量瓶，加水定容，然后量取10 mL移至25 mL容量瓶中，用30% NaOH調(diào)至中性，加水定容至刻度。取樣液2.0 mL置25 mL試管中，加入1.0 mL磷酸鹽緩沖液和1.0 mL 2%茚三酮，搖勻，沸水浴30 min，冷卻加水定容至25 mL，利用UV-2550分光光度計(jì)測(cè)定570 nm吸光值。以天冬氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理并作圖，利用SPSS軟件進(jìn)行LSD差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CO2倍增處理對(duì)鐵皮石斛光合特性的影響

由表1可知，CO2倍增處理和對(duì)照的鐵皮石斛葉片凈光合速率（Pn）前期均逐漸增加，在處理后20 d達(dá)到最大值后稍有下降，并維持相對(duì)穩(wěn)定的水平，這表明光合速率隨著葉片的生長(zhǎng)而相應(yīng)提高，且CO2倍增處理的Pn顯著高于對(duì)照；處理后30 d，CO2倍增處理和對(duì)照的Pn分別為5.57、3.84 μmol/（m2·s），差異達(dá)到最大。同時(shí)，在CO2倍增處理的180 d期間，鐵皮石斛沒有出現(xiàn)“光合適應(yīng)”現(xiàn)象。

整體上看，CO2倍增處理對(duì)鐵皮石斛葉片的胞間CO2濃度（Ci）沒有顯著影響（表1），CO2倍增處理及對(duì)照在30 d時(shí)均達(dá)到最大值且差異顯著，CO2倍增處理的Ci比對(duì)照增加7%，在倍增處理150～180 d期間，鐵皮石斛葉片的Ci與對(duì)照總體上沒有顯著差異，并均維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平，這可能與CO2倍增處理顯著增加鐵皮石斛葉片的Pn有關(guān)。

表1 CO2倍增處理對(duì)鐵皮石斛葉片凈光合速率、胞間CO2濃度和氣孔導(dǎo)度的影響Table 1 Effects of doubling the CO2 concentration on net photosynthetic rate，intercelllular CO2 concentration and stomatal conductance in leaves of D.officinale

CO2倍增處理也顯著增加了鐵皮石斛葉片的氣孔導(dǎo)度（Gs），平均增加20%，其中CO2倍增處理60 d后Gs達(dá)到最大值，為0.056 mol/（m2·s），比同期對(duì)照顯著增加27%。氣孔導(dǎo)度的增大必然會(huì)導(dǎo)致蒸騰速率（Tr）的增加。由表2可知，CO2倍增處理鐵皮石斛葉片的Tr顯著高于同期的對(duì)照，平均增加21%，其中CO2倍增處理的前30 d，對(duì)照和處理葉片的Tr均顯著增加，在30 d時(shí)達(dá)到最大值，CO2倍增處理為1.35 mmol/（m2·s），比同期對(duì)照顯著增加35%。隨后，Tr呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，在60 d時(shí)比30 d下降13.45%，但仍然高于同期的對(duì)照。

植物水分利用效率（WUE）能在一定程度上反映植物的耗水性和抗寒性。CO2倍增處理20 d和30 d，鐵皮石斛的WUE均超過對(duì)照，但差異不顯著；CO2倍增處理60 d后，鐵皮石斛的WUE顯著高于同期對(duì)照，且呈逐漸增加的趨勢(shì)；CO2倍增處理120 d，鐵皮石斛的WUE出現(xiàn)最大差異值，比對(duì)照顯著提高47%。雖然在CO2倍增條件下，鐵皮石斛葉片的Tr總體上高于對(duì)照，但CO2倍增增加光合同化CO2的物質(zhì)的量（Pn）的幅度遠(yuǎn)大于其引起的蒸騰散失H2O的物質(zhì)的量（Tr）的幅度，進(jìn)而使得CO2倍增處理的WUE在 60 d后就一直顯著高于對(duì)照（表2）。

表2 CO2倍增處理對(duì)鐵皮石斛葉片蒸騰速率、水分利用率和可溶性蛋白含量的影響Table 2 Effects of doubling the CO2 concentration on transpiration rate，water use efficiency and soluble protein content in leaves of D.officinale

2.2 CO2倍增處理對(duì)鐵皮石斛葉片可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

由表2可知，鐵皮石斛單位葉片的可溶性蛋白質(zhì)含量隨著栽培時(shí)間的延長(zhǎng)而呈增加趨勢(shì)，但CO2倍增處理90 d前增加不顯著。CO2倍增處理90 d后，對(duì)照和處理均出現(xiàn)顯著增加并維持在一個(gè)穩(wěn)定水平，但CO2倍增處理的增幅顯著大于對(duì)照，在120 d達(dá)到最大值4.37 mg/g（FW），比對(duì)照提高19%。

2.3 CO2倍增處理對(duì)鐵皮石斛生長(zhǎng)的影響

由表3可知，CO2倍增處理對(duì)鐵皮石斛的生長(zhǎng)有顯著影響。在試驗(yàn)處理180 d后，CO2倍增處理的干質(zhì)量和鮮質(zhì)量均顯著高于對(duì)照，分別增加30%和13%。CO2倍增雖然對(duì)莖粗無顯著影響，但莖高顯著增加49.3%（圖1）。同時(shí)，CO2倍增處理的單株葉片數(shù)和葉片厚度也顯著增加、分別提高42%和3.5%，但鐵皮石斛的單葉面積和比葉面積顯著降低、分別下降11.8%和20%。

表3 CO2倍增處理對(duì)鐵皮石斛生長(zhǎng)的影響Table 3 Effects of doubling the CO2 concentration on growth of D.officinale

圖1 CO2倍增處理180 d 后鐵皮石斛的生長(zhǎng)情況Fig.1 Growth of D.officinale after doubling the CO2 concentration for 180 d

2.4 CO2倍增處理對(duì)鐵皮石斛有效成分含量的影響

從表4可以看出，CO2倍增處理能夠影響鐵皮石斛有效成分的含量。CO2倍增處理180 d后，鐵皮石斛莖中的多糖、生物堿、總氨基酸和總黃酮含量均有一定程度的提高，但與對(duì)照無顯著差異。

表4 CO2倍增對(duì)鐵皮石斛有效成分含量的影響Table 4 Effects of doubling the CO2 concentration on the contents of effective components of D.officinale

3 討論

CO2作為植物光合作用的原料之一，其濃度的增加有利于提高植物的凈光合效率，促進(jìn)植物其他相關(guān)代謝活動(dòng)的進(jìn)行［20］。前人研究發(fā)現(xiàn)，在CO2倍增條件下，植物的凈光合速率提高了19%～68.2%，氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率有所下降，提高了瞬時(shí)水分利用率［21-24］。本研究中，CO2倍增處理顯著增加了鐵皮石斛葉片的氣孔導(dǎo)度（Gs），CO2倍增處理60 d達(dá)到最大值，這可能與鐵皮石斛生境的相對(duì)濕度較高有關(guān)，水分是影響氣孔運(yùn)動(dòng)的最主要的外界因素，在相對(duì)濕度較高的情況下，Gs會(huì)相應(yīng)增大。即使在倍增條件下，胞間CO2濃度依然較低，植物提高氣孔導(dǎo)度以便獲取更多的CO2進(jìn)行光合作用。

長(zhǎng)期CO2倍增作用下植物會(huì)出現(xiàn)“光合適應(yīng)”或“光合下調(diào)”現(xiàn)象［25-26］。對(duì)大豆［27］、金釵石斛［28］等的研究發(fā)現(xiàn)，這些植物在長(zhǎng)期CO2倍增作用下并沒有出現(xiàn)“光合適應(yīng)”現(xiàn)象。本研究中，CO2倍增大大提高了鐵皮石斛的光合能力，也沒有出現(xiàn)“光合適應(yīng)”現(xiàn)象。

大部分植物在長(zhǎng)期CO2倍增條件下都會(huì)出現(xiàn)葉片可溶性蛋白質(zhì)含量下降的現(xiàn)象，如蝴蝶蘭［21］、芥菜［23］等。但另有研究表明CO2倍增引起大豆可溶性蛋白質(zhì)含量增加，原因可能是豆科植物具有根瘤菌，能夠從空氣中獲取氮素，以適應(yīng)植物在高CO2濃度下快速生長(zhǎng)對(duì)氮素的需求［29］，但大多數(shù)非豆科植物并不具備這種功能。CO2倍增降低植物體內(nèi)N濃度的機(jī)制還不大清楚，有學(xué)者提出CO2倍增提高了N的獲取，并在一定程度上促進(jìn)植物生長(zhǎng)［30］，單國雷等［31］也發(fā)現(xiàn)CO2倍增增加了西瓜可溶性蛋白質(zhì)含量。本研究中，CO2倍增處理后期（120～180 d），鐵皮石斛單位葉片可溶性蛋白質(zhì)含量顯著增加，這可能是由于CO2倍增條件下鐵皮石斛生長(zhǎng)較快，有機(jī)物積累增多，第4片功能葉為倍增條件下新長(zhǎng)的葉片，加上施用的高氮肥滿足了鐵皮石斛新葉對(duì)N的需求，從而促進(jìn)了可溶性蛋白質(zhì)的積累。

Centritto等［32］研究發(fā)現(xiàn)，CO2倍增促進(jìn)了白楊葉片的生長(zhǎng)，增加了葉片的數(shù)量，但對(duì)葉面積沒有顯著影響。本研究中鐵皮石斛的葉片數(shù)和葉片厚度顯著增加，但其單葉面積和比葉面積明顯降低。鐵皮石斛莖的干質(zhì)量和鮮質(zhì)量分別顯著提高30%和13%；莖高顯著增加49.3%，但對(duì)鐵皮石斛的莖粗沒有顯著影響。葉面積的減少有利于減少蒸騰速率進(jìn)而提高植物的水分利用率。對(duì)同一物種，比葉面積的下降有助于植物在獲取更多光能的同時(shí)保證自身不受強(qiáng)光的傷害［33］。

CO2倍增會(huì)誘導(dǎo)植物的營(yíng)養(yǎng)組分發(fā)生變化，如初級(jí)生產(chǎn)、營(yíng)養(yǎng)物在植物不同部位的循環(huán)、化學(xué)成分的比例和可食用部位的產(chǎn)量等［34-35］，進(jìn)而改變作物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。H?gy等［36］對(duì)春小麥進(jìn)行了3年CO2施肥的研究發(fā)現(xiàn)，CO2施肥后春小麥的地上生物量增加了11.8%，谷物產(chǎn)量增加了10.4%，但CO2加富后谷物顯著變小，谷物中的蛋白質(zhì)顯著下降，因而引起氨基酸含量下降。Mamatha等［37］對(duì)番茄進(jìn)行700 μmol/mol CO2施肥，發(fā)現(xiàn)CO2施肥增加了番茄的氨基酸含量，但CO2加富后的總酚、總黃酮、抗氧化物質(zhì)和番茄紅素含量都出現(xiàn)了下降。鄭金英等［8］發(fā)現(xiàn)，CO2加富能夠促進(jìn)番茄果實(shí)中淀粉的轉(zhuǎn)化和還原糖的積累，較高濃度的CO2能夠促進(jìn)果實(shí)生長(zhǎng)前期合成類酶活性的增強(qiáng)和后期蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性的增強(qiáng)，且800 μmol/mol處理下成熟期果實(shí)中還原糖含量最高。張志鵬等［9］認(rèn)為800 μmol/mol CO2時(shí)最經(jīng)濟(jì)實(shí)用，該倍增處理使可溶性固形物含量增加了6.7%，蔗糖含量增加了12.7%，果糖含量增加了6.0%。本研究中，CO2倍增處理同樣也是采用800 μmol/mol的CO2，與對(duì)照相比，鐵皮石斛莖的多糖、生物堿、總氨基酸和總黃酮含量均有所提高，但差異不顯著。由于本次試驗(yàn)材料為鐵皮石斛一年生莖，CO2倍增處理和對(duì)照的莖多糖含量暫未達(dá)到藥典的標(biāo)準(zhǔn)［16］，而隨著栽培時(shí)間的延長(zhǎng)，鐵皮石斛莖中的多糖含量會(huì)不斷積累，絕大部分鐵皮石斛莖多糖積累量的高峰值出現(xiàn)二年生莖中，而鐵皮石斛有效成分含量的后續(xù)變化將有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

CO2倍增處理能夠提高鐵皮石斛的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率和水分利用率，而處理180 d后，鐵皮石斛主要藥用部位莖的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和高度均顯著增加，從而提高了莖產(chǎn)量，但莖的多糖、生物堿、總氨基酸和總黃酮等有效成分的含量與對(duì)照無顯著差異。