馬孟莉 王田濤 雷 恩 孟衡玲 張 薇 張婷婷 盧丙越

（紅河學院生命科學與技術學院/云南省高校滇南特色生物資源研究與利用重點實驗室，661100，云南蒙自）

草果（Amomum tsao-koCrevost et Lemaire）是姜科豆蔻屬（AmomumL.）多年生草本植物，全珠具有辛辣味，其果實是一種常用的中藥，具有清濕化痰和溫脾祛寒的功效，草果也是主要的調味品之一[1-2]。草果主要分布于我國云南、廣西、貴州以及越南北部等地區(qū)，是熱帶、亞熱帶森林中一種重要的經(jīng)濟作物[3]。云南省是草果的主產(chǎn)區(qū)，產(chǎn)量和種植面積約占中國的95%。據(jù)2016年數(shù)據(jù)統(tǒng)計，云南省草果種植面積22.93萬hm2，其中紅河州6.93萬hm2。紅河州金平縣因種植面積大且草果質量好，被稱為“草果之鄉(xiāng)”，種植歷史有400余年[4]。

遺傳多樣性的研究對草果資源的保護和利用具有重要意義。表型性狀具有易于識別和掌握、簡單直觀和快速等優(yōu)點，被廣泛應用于植物遺傳多樣性研究[5-8]。隨著分子生物學技術的發(fā)展，DNA分子標記技術因其不受環(huán)境及發(fā)育階段影響而被廣泛用于遺傳多樣性研究。SSR分子標記具有重現(xiàn)性好、共顯性、分布范圍廣的優(yōu)點。從表型性狀和分子水平兩方面共同分析植物的遺傳多樣性，對其種質資源的利用與保護具有十分重要的意義。

作為中藥和調味品的草果，之前的研究主要集中在精油提取、化學成分分析和藥理作用等方面[9-11]，而關于草果種質資源遺傳多樣性方面的研究報道較少，限制了草果優(yōu)異種質篩選及育種利用。近年來，隨著人們對草果資源鑒定及保護意識的加強，關于草果遺傳多樣性方面的研究逐漸增多。Zhang等[12]對云南省9個產(chǎn)區(qū)草果果實性狀進行表型分析，結果表明，果實脊數(shù)、單果種子數(shù)和果實垂直直徑的變異最大。謝正萬等[13]利用12個草果單株對適用于草果遺傳多樣性分析的RAPD引物進行了篩選；Yang等[14]利用9對SSR標記初步分析了云南3個居群的60個草果樣品的遺傳多樣性；胡一凡等[15]利用7對SSR引物對云南草果的遺傳多樣性進行了系統(tǒng)分析，結果表明，云南草果的遺傳多樣性水平較高，其中來自金平的JP1（10個樣本）和JP2（10個樣本）兩個居群各項多樣性參數(shù)均最高，遺傳多樣性最為豐富，這與金平縣作為“草果之鄉(xiāng)”，栽培草果歷史悠久，是國內草果原產(chǎn)地之一的報道相符[4]。鑒于前人研究樣本數(shù)量偏少且未對金平地區(qū)的草果進行表型分析，本研究利用13個表型性狀和5對SSR分子標記對云南省草果主產(chǎn)區(qū)紅河州金平縣44份草果樣本進行遺傳多樣性分析，以期為草果資源的保存和可持續(xù)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與表型測定

試驗于2016年在紅河學院生命科學與技術學院進行。44個樣本隨機從2015年采自云南省金平縣阿得博鄉(xiāng)草果山（22°54′36″N，103°13′12″E）的152份草果樣本中選取。根據(jù)前期實地調研，采樣地草果種植歷史悠久，種植面積大，類型豐富。因此，為保證樣本的代表性，將植株形態(tài)、果實性狀等作為參考依據(jù)，且樣本之間的直線距離不小于50m，所有樣本經(jīng)紅河學院云南省高校滇南特色生物資源研究與利用重點實驗室的張薇副教授鑒定為姜科豆蔻屬植物草果，標本存放于紅河學院生命科學與技術學院。每個樣本隨機選擇3個果穗，統(tǒng)計每個果穗上的小花數(shù)及掛果數(shù)，計算掛果率（每穗掛果數(shù)/每穗小花數(shù)）。每個樣本隨機選取10個果子用數(shù)顯游標卡尺測量鮮果長、鮮果寬，用萬分之一天平稱量鮮果重，3次重復；果實置于100℃恒溫烘箱中烘至恒重，每個樣本選取10個干果分別用數(shù)顯游標卡尺測量干果長、干果寬，用萬分之一天平稱量干果重、干果皮重和種子團重，并統(tǒng)計單果種子數(shù)，3次重復。在采樣同時，收集每個樣本幼嫩的葉片，置于含有硅膠的5mL離心管中，用于后續(xù)DNA的提取。

1.2 DNA提取和PCR擴增

采用CTAB法提取草果基因組DNA，并用NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測DNA濃度和質量，將不同草果樣本基因組DNA稀釋至20ng/μ L的工作溶液，并保存于4℃冰箱中備用。

5對SSR引物序列選自Yang等[14]的研究結果，引物序列見表1。10 μ L聚合酶鏈式反應（PCR）體系包含：1.0 μ L 模板 DNA（20ng/μ L）、0.8 μ L SSR 引物（0.2 μ mol/L）、0.8 μ L dNTPs（2.5mol/L）、1.2 μ L 10×PCR 緩沖液（含 Mg2+）、0.2 μ LTaqDNA 聚合酶（2.5U/μ L）、6 μ L ddH2O，反應體系所用試劑均購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。所有擴增均在PCR儀上進行。反應程序為95℃預變性5min；95℃ 30s，55℃～59℃ 30s，72℃ 30s，共 30 個循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃保溫。擴增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺=19∶1）上分離，電泳結束后用1% AgNO3染色，待條帶清晰后拍照保存。

表1 SSR引物信息表Table 1 List of SSR markers used

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016統(tǒng)計各性狀數(shù)據(jù)，計算各性狀的最小值、最大值、平均值、標準差、變異幅度和變異系數(shù)等基本統(tǒng)計參數(shù)。采用Shannon-Weaver多樣性指數(shù)（H′）評價各性狀的遺傳多樣性，H′=-Σ(Pi)(lnPi)，Pi表示第i種變異類型出現(xiàn)的頻率。利用SPSS 19.0軟件對草果表型性狀進行主成分分析。

根據(jù)PCR擴增結果，選擇重復性好、譜帶清晰的SSR標記記錄。在相同遷移位置上有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，缺失用“—”表示。利用最終獲得的數(shù)據(jù)矩陣，用POPGENE 1.32軟件包計算多態(tài)帶百分比（PPB），觀測等位基因數(shù)（Na），有效等位基因數(shù)（Ne），觀測雜合度（Ho），期望雜合度（He）和 Shannon′s信息指數(shù)（I）。使用PowerMarker V3.25計算多態(tài)性信息含量（PIC）。參考Prevost等[16]的方法計算每對引物的解析度（Rp）：Rp=ΣIb，其中條帶信息Ib=1-（2×|0.5-p|），p指44個樣本中含有該片段的頻率。利用NTSYS-2.10e軟件中的SIMQUAL模塊計算樣本之間的遺傳相似性系數(shù)，采用非加權平均數(shù)法（UPGMA）進行樣本聚類分析，獲得樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 草果表型多樣性分析

在13個數(shù)量性狀中，掛果率、每穗花數(shù)、種子團重、干果長寬比和干果重的變異系數(shù)均在20.00%以上，其中掛果率的變異系數(shù)最大，變異系數(shù)為50.00%。鮮果寬的變異系數(shù)最小，為7.64%。13個性狀的H′為1.74～2.16，其中鮮果長（2.16）、干果長寬比（2.07）、每穗花數(shù)（2.04）、單果種子數(shù)（2.03）、干果寬（2.01）和果皮重（2.00）的H′均在2.00以上，這些性狀表型多樣性水平較高（表2）。進一步通過主成分分析對13個性狀進行降維，提取的前4個主成分累積貢獻率達到81.615%（表3）。第1主成分貢獻率為37.369%，主要為干果皮重、鮮果重、干果重、單果種子數(shù)、鮮果寬和干果寬等性狀，其特征向量絕對值都在0.700以上，主要反映草果質量，與產(chǎn)量密切相關；第2主成分解釋了總變異的25.049%，主要貢獻來自干果長寬比、鮮果長寬比、干果長和鮮果長，這些性狀與果實的形狀有關，故第2主成分為果型因子；第3主成分和第4主成分的貢獻率分別為12.152%和7.046%，第3主成分的貢獻主要來自每穗花數(shù)，第4主成分的貢獻則主要來自掛果率。

表2 草果數(shù)量性狀多樣性分析Table 2 Diversity analysis of quantitative traits of Amomum tsao-ko

表3 基于表型性狀的草果主成分分析Table 3 Principal component analysis based on phenotypic traits of Amomum tsao-ko

2.2 草果SSR多樣性分析

5對SSR引物在44個草果樣本中共擴增出23個條帶，多態(tài)帶百分比為100%。其中AT29和AT30擴增條帶數(shù)最多，AT56最少，平均每對引物可以擴增出4.6個多態(tài)性條帶。所檢測樣本的Ne介于 1.646～4.418，平均為 3.410；Ho介于 0.150～0.731，平均為 0.491；He介于 0.398～0.789，平均為 0.679；I最高為 1.581，最低為 0.582；PIC 為 0.405～0.763，平均為0.672。這些參數(shù)說明金平草果具有較高的遺傳多樣性水平，其中AT29引物的解析度最大，對不同草果樣本的區(qū)分能力最強（表4）。

表4 草果SSR引物多態(tài)性分析Table 4 Polymorphism analysis of Amomum tsao-ko with SSR primers

2.3 基于SSR標記的聚類分析

基于SSR標記的草果樣本間的遺傳相似系數(shù)介于0.273～0.929。UPGMA聚類分析顯示，在相似性系數(shù)0.60處可將44個樣本分為2大類。類群I包括34個樣本，類群II包括10個樣本。以相似性系數(shù)0.619為閾值，類群I可進一步分為2個亞群，亞群IA由26個樣本組成，亞群IB由8個樣本組成，亞群IB又可分為2組（IB1和IB2）。以遺傳相似系數(shù)0.662為閾值時，IA亞群可分為IA1（22個樣本）和IA2（4個樣本）2組，以遺傳相似系數(shù)0.681為閾值時，IA1又進一步分為IA1a（11個樣本）和IA1b（11個樣本）2個亞組。類群II在相似性系數(shù)0.670處可分為2個亞群IIA和IIB。在IA1a中，J1、J7和J8以及J10和J23具有較高的相似性，IA1b亞組中的J15和J35也具有較高的遺傳相似性（圖1）。

3 討論

圖1 基于SSR標記的44份草果樣本的聚類圖Fig.1 Cluster diagram of 44 Amomum tsao-ko individuals based SSR markers

所調查的草果表型中鮮果長和干果長寬比的H′最高，這2個性狀與草果果實形狀密切相關，說明草果在果實形狀上具有豐富的類型，雷恩等[17]依據(jù)草果的果實形狀和揮發(fā)氣味將草果栽培種分為圓紅辛辣型、圓黃蘋果型、橢紅辛辣型和梭紅辛辣型，可見草果果實形狀可作為區(qū)分不同草果類型的重要依據(jù)。在13個被測性狀中掛果率的變異系數(shù)最大，為50.00%，表明草果掛果率在個體間差異明顯，是影響產(chǎn)量穩(wěn)定的重要因素，雷恩等[18]研究草果產(chǎn)量構成時也發(fā)現(xiàn)增加草果掛果率對穩(wěn)定和提高草果植株產(chǎn)量具有重要的意義。主成分分析提取的前4個主成分可反映13個性狀的大部分信息，貢獻率分別占到37.369%、25.049%、12.152%和7.046%，累積貢獻率達81.615%。在第1主成分中干果皮重、鮮果重、干果重、單果種子數(shù)、鮮果寬和干果寬等性狀荷載值最高，且性狀之間呈正相關關系，說明果實寬、單果種子數(shù)多的類型果實重量較大；第2主成分中干果長寬比、鮮果長寬比、干果長和鮮果長貢獻最大，屬于果型因子，該主成分中種子團重和干果重與干果寬等性狀呈負相關關系，表明長果型草果果重偏低。掛果率是決定產(chǎn)量最重要的因素，但該性狀與果實重、果實長和果實直徑等與產(chǎn)量密切相關的性狀呈負相關關系，在草果高產(chǎn)品種選育及栽培上要協(xié)調好這些性狀之間的關系，通過優(yōu)化各產(chǎn)量構成因素指標達到增產(chǎn)的目的。此外，草果精油及其成分是評價草果品質的重要方面，研究產(chǎn)量構成和精油含量及其成分之間的關系對高產(chǎn)優(yōu)質草果種質（品種）的選育具有重要意義，是后續(xù)研究的重點。

本研究利用5對SSR引物對金平草果種質資源進行了遺傳多樣性分析。結果表明，這些樣本具有較高的遺傳多樣性，Na=4.6、Ho=0.491和He=0.679，高于Yang等[14]利用SSR標記分析保山居群（Na=2、Ho=0.339、He=0.456）、法斗居群（Na=2、Ho=0.372、He=0.444）和馬關居群（Na=2、Ho=0.250、He=0.432）的各項參數(shù)。胡一凡等[15]利用SSR標記分析云南不同產(chǎn)地草果遺傳多樣性得出，金平居群草果的遺傳多樣性水平最高，其中JP1 居群的Na、Ne、Ho、He和H(I)分 別 為 2.143、1.753、0.368、0.395和 0.603；JP2居群的分別為2.143、1.817、0.297、0.431和0.648，2個居群的各項遺傳參數(shù)均低于本研究的結果，這與金平悠久的草果栽培歷史，是我國草果原產(chǎn)地之一情況相一致。在本研究中，根據(jù)相似系數(shù)，44個草果樣品被分為2個類群。類群Ⅰ為主類群，由34個草果樣本組成，下面又由多個亞群組成，進一步說明金平草果類型豐富，多樣性水平較高。

根據(jù)前人及本研究的結果可以判斷金平縣是我國草果的原產(chǎn)地。近年來，由于草果病蟲害嚴重、加之草果栽培管理粗獷、產(chǎn)量易受環(huán)境條件影響等原因，導致部分農(nóng)民放棄種植草果，嚴重威脅到草果遺傳多樣性的維持。鑒于金平草果豐富的多樣性，系統(tǒng)收集金平范圍內的草果種質，在當?shù)亟⒉莨N質資源圃，對草果資源保護和育種利用具有重要意義。

4 結論

通過13個數(shù)量性狀指標和5對SSR標記分析金平草果遺傳多樣性水平，結果表明，金平草果具有豐富的表型變異和SSR標記多樣性。13個數(shù)量性狀的變異系數(shù)為7.64%～50.00%，H′為1.74～2.16；5對SSR標記在44個樣本中共擴增出23個條帶，多態(tài)位點百分率為100%，I和平均PIC分別為1.266和0.672；聚類分析將44個樣本分為2大類，類群Ⅰ包括34個樣本，類群Ⅱ包括10個樣本。