趙園園，孟金柱

（銅仁學(xué)院 農(nóng)林工程與規(guī)劃學(xué)院，貴州 銅仁 554300）

1 引言

黑色素在黑色素細胞的黑素小體中合成，并轉(zhuǎn)運到鄰近的角化細胞，使皮膚和毛發(fā)呈現(xiàn)出顏色。黑色素細胞是由神經(jīng)嵴細胞分化而來的，中間經(jīng)歷黑色素母細胞和黑色素干細胞，其中黑色素母細胞需遷移至表皮及毛囊，黑色素干細胞需要遷移到毛母質(zhì)區(qū)分化成黑色素細胞，或定居于毛囊外根鞘 Bulge 區(qū)作為儲存庫[1]。

神經(jīng)嵴細胞向黑色素細胞的分化主要受 Wnt信號通路和BMP信號通路的調(diào)控[2]。其中，Wnt家族的蛋白是分泌型糖蛋白，通過細胞表面受體介導(dǎo)調(diào)控發(fā)揮作用[3]。Wnt3a 作為 Wnt 家族的成員之一，通過與黑色素細胞表面的受體FZD結(jié)合，在促進神經(jīng)嵴細胞向黑色素細胞的分化、黑色素的合成過程中起重要作用[4]。

先前的研究表明，Wnt3a 在黑色素細胞外，通過與細胞表面的受體結(jié)合發(fā)揮作用，但對其在黑色素細胞內(nèi)的作用研究較少。本研究培養(yǎng)小鼠黑色素細胞，通過免疫熒光技術(shù)對黑色素細胞中Wnt3a 蛋白進行定位研究，為進一步探究 Wnt3a在色素沉積中的作用提供基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 材料

本研究所用小鼠黑色素細胞由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)羊駝生物工程實驗室提供。

2.2 方法

2.2.1 細胞培養(yǎng) 細胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代、凍存方法參照MiR-27a-3p對黑色素生成的作用及機制研究[5]。

2.2.2 免疫熒光 當(dāng)培養(yǎng)的黑色素細胞密度達到80%左右時，進行傳代，傳代細胞均勻平鋪于鋪有經(jīng)1%鹽酸處理的蓋玻片的6孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞長滿，棄培養(yǎng)基，滅菌的PBS清洗細胞3次，以去除死細胞。4%多聚甲醛低溫固定30 min，取出蓋玻片，PBS洗3次，每次3 min，0.5%TritonX-100室溫20 min，BS洗3次，每次3 min，室溫下用山羊血清封閉30 min，滴加 Wnt3a抗體（ab219412，abcam，1：200 稀釋）濕盒中4℃ 過夜孵育，復(fù)溫30 min，PBST洗3次，SABCFITC（山羊IgG）（1：100，博士德）37℃ 孵育1 h，PBST 洗 3次，吸干水，抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下用藍光激發(fā)熒光，觀察，采集圖像。

3 結(jié)果

3.1 小鼠皮膚黑色素細胞生長狀況

待小鼠皮膚黑色素細胞生長至密度為 80%左右時，顯微鏡下觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)細胞排列緊密，呈鵝卵石狀，細胞有1～3個突起。細胞排列密集時，突起減少，分布稀疏時，細胞突起明顯且較多（見圖 1）。

圖1 小鼠黑色素細胞

3.2 Wnt3a 在小鼠皮膚黑色素細胞中的表達

圖2 Wnt3a在綿羊皮膚黑色素細胞中的表達定位

通過免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，Wnt3a 在小鼠皮膚黑色素細胞中有表達，且表達部位主要集中在細胞核附近，其他部位表達量較少（見圖 2）。

4 討論

本研究通過免疫熒光技術(shù)對成熟的皮膚黑色素細胞中 Wnt3a 的表達進行研究，結(jié)果表明，Wnt3a 蛋白在成熟黑色素細胞中表達，這與筆者先前通過QRT-PCR 和 Western Blot檢測結(jié)果一致，Wnt3a在小鼠皮膚黑色素細胞中表達[5]。郭海英通過免疫組化檢測小鼠毛囊 Wnt3a的表達，發(fā)現(xiàn)在小鼠毛囊的生長期，毛球部的黑色素細胞表達 Wnt3a[1]。宋云飛檢測不同毛色羊駝皮膚中 Wnt3a 的表達，也發(fā)現(xiàn)其在毛球部和根鞘表達，這些結(jié)果也與本研究結(jié)果相契合[6]。

Wnt3a可以促進神經(jīng)嵴細胞分化為黑色素細胞，且在黑素色生成過程中發(fā)揮積極作用，但 Wnt3a 抑制成熟黑色素細胞的增殖[7]。Wnt/β-catenin 信號通路需要與受體結(jié)合發(fā)揮作用，Wnt3a已知的受體包括Fzd1、Fzd3、Fzd8和LRP6[4,8,9]。在黑色素合成過程中，Wnt3a主要通過上調(diào) Mitf、Tyr、Tyrp1 的表達，從而增加酪氨酸酶活性和黑色素合成[7]。