李亞 李春梅

肺腺癌是臨床常見(jiàn)惡性腫瘤之一，臨床常采用化療等方法治療肺腺癌，但肺腺癌細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生導(dǎo)致患者預(yù)后差[1-3]。因而尋找新型治療方法對(duì)提高肺腺癌患者生存率及改善患者預(yù)后均具有重要意義。硝呋齊特(nifuroxazide)屬于硝基呋喃類(lèi)抗生素，研究表明硝呋齊特具有抗炎、抗感染等作用[4]。相關(guān)報(bào)道指出硝呋齊特具有抗腫瘤作用，并可抑制肝癌等腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[5]。但硝呋齊特在肺腺癌中的作用尚未可知。微小RNA(microRNA，miRNA)可調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后水平及翻譯水平從而調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育等過(guò)程，研究表明微小RNA-219-5p(microRNA-219-5p，miR-219-5p)在肺腺癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)并可參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程[6-7]。本研究主要探討硝呋齊特對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響，并探究其是否通過(guò)調(diào)控miR-219-5p表達(dá)而發(fā)揮作用，以期為臨床合理應(yīng)用硝呋齊特提供理論依據(jù)。

資料與方法

一、材料與試劑

硝呋齊特購(gòu)自湖北貓爾沃生物醫(yī)藥有限公司；肺腺癌A549細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清與0.25%胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；miR-219-5p抑制劑(anti-miR-219-5p)及其陰性對(duì)照(anti-miR-con)購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；二 喹 啉 甲 酸 (bicinchoninicacid，BCA)蛋白定量檢測(cè)試劑盒與蛋白裂解液均購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；Lipofectamine2000與Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；兔抗人B淋巴細(xì)胞瘤-2 ( Bcl-2)、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白( Bax)單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；甲基噻唑基四唑( methylthiazolyl tetrazolium，MTT)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶( Propidium Iodide，PI) 細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司。

二、方法

1 實(shí)驗(yàn)處理與分組 肺腺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清與青霉素-鏈霉素混合溶液)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，用不同濃度(2.5、5、10 μmol/L)的硝呋齊特處理細(xì)胞，分別命名為2.5 μmol/L nifuroxazide組、5 μmol/L nifuroxazide組、10 μmol/L nifuroxazide組，未經(jīng)任何處理的細(xì)胞作為Control組[8]，各組細(xì)胞處理時(shí)間為48 h，MTT實(shí)驗(yàn)篩選適宜作用濃度用于后續(xù)研究。A549細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染anti-miR-219-5p、anti-miR-con，隨后用濃度為10 μmol/L的硝呋齊特處理48 h，分別命名為nifuroxazide+anti-miR-219-5p組、nifuroxazide +anti-miR-con組。

2 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，加入DMEM培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為3×104個(gè)/mL，按照每孔3×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板，按照“1.2.1”分組處理，每孔加入20 μL MTT溶液(濃度5 mg/mL)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入150 μL二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)，低速振蕩10 min，應(yīng)用SpectraMaxM5酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm時(shí)各孔吸光度值(A值)。

3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，按照每孔1×106/mL的密度接種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右，按照“1.2.1”分組進(jìn)行處理，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌2次，依次加入5 μL Annexin V-FITC與5 μL PI，室溫避光孵育10 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，胰蛋白酶消化后加入不含血清的DMEM培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液(5×104個(gè)/mL)，接種于Transwell小室的上室(200 μL/孔)，Transwell小室的下室加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液(600 μL)，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，棄上清液，PBS洗滌，多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌，0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，用棉簽擦掉未遷移細(xì)胞，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察遷移細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：用預(yù)冷培養(yǎng)液稀釋Matrigel基質(zhì)膠(9:1)，Matrigel稀釋液平鋪于Transwell小室上室(40 μL/孔)，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱孵育5 h，其余步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞中miR-219-5p表達(dá)水平 采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，miR-219-5p正向引物5′-ACACTCCAGCTGGGTGATTGTCCAACGC-3′，反向引物：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6正向引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，參照試劑盒配置反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10μL/孔，正反向引物0.8 μL/孔，cDNA 1 μL/孔，ddH2O補(bǔ)足體系至20 μL；反應(yīng)條件：95℃ 2 min(循環(huán)1次)，95℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 30 s(循環(huán)35次)。miR-219-5p以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-219-5p相對(duì)表達(dá)量。

6 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè)Bax、Bcl2蛋白表達(dá) 收集各組A549細(xì)胞，加入適量蛋白裂解液，裂解30 min(冰上)，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)電泳分離蛋白，每孔加樣30 μg(變性蛋白)，分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫條件下采用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗(1 ∶1000)4℃孵育24 h，TBST洗滌，分別加入相應(yīng)二抗(1 ∶2000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌，加入ECL化學(xué)發(fā)光劑，曝光顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、硝呋齊特對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549活力的影響

與Control組相比，5μmol/L nifuroxazide組、10μmol/L nifuroxazide組肺腺癌A549細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)，由于硝呋齊特使用劑量10 μmol/L時(shí)細(xì)胞活力相對(duì)較低，因而選用10 μmol/L硝呋齊特進(jìn)行后續(xù)研究(見(jiàn)表1)。

表1 硝呋齊特對(duì)A549細(xì)胞活力的影響

注：nifuroxazide：硝呋齊特；與control組比較，*P<0.05

二、硝呋齊特對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

與Control組相比，nifuroxazide組A549細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，Bcl2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)(見(jiàn)圖1、2、表2)。

圖1 硝呋齊特對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

圖2 Western blot檢測(cè)硝呋齊特對(duì)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

三、硝呋齊特對(duì)A549細(xì)胞遷移、侵襲的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對(duì)于Control組，nifuroxazide組A549細(xì)胞遷移與侵襲數(shù)均顯著減少(P<0.05)(見(jiàn)圖3、表3)。

表2 硝呋齊特對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

注：與control組比較，*P<0.05

表3 硝呋齊特對(duì)A549細(xì)胞遷移、侵襲的影響

注：與Control組比較，*P<0.05

圖3 硝呋齊特對(duì)A549細(xì)胞遷移、侵襲的影響

四、硝呋齊特對(duì)A549細(xì)胞中miR-219-5p表達(dá)的影響及anti-miR-219-5p的轉(zhuǎn)染效果

與Control組比較，nifuroxazide組A549細(xì)胞中miR-219-5p表達(dá)水平顯著升高；相較于nifuroxazide +anti-miR-con組，nifuroxazide+anti-miR-219-5p組A549細(xì)胞中miR-219-5p表達(dá)水平顯著降低(見(jiàn)表4)。

五、抑制miR-219-5p的表達(dá)逆轉(zhuǎn)硝呋齊特對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用

與nifuroxazide +anti-miR-con組相比，nifuroxazide+anti-miR-219-5p組A549細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Bcl2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。(見(jiàn)圖4、表5)。

表4 硝呋齊特對(duì)A549細(xì)胞中miR-219-5p表達(dá)的影響及anti-miR-219-5p的轉(zhuǎn)染效果

注：與control組比較，*P<0.05；與nifuroxazide +anti-miR-con組比較，#P<0.05

圖4 Western blot檢測(cè)A549細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量

討 論

肺腺癌的主要病理類(lèi)型是非小細(xì)胞肺腺癌，目前臨床現(xiàn)有醫(yī)療水平可提高肺腺癌患者生存率，但治療效果具有一定局限性，晚期肺腺癌患者5年生存率較低[9-10]。肺腺癌細(xì)胞呈侵襲性生長(zhǎng)，增加患者死亡率，細(xì)胞惡性增殖可促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展[11]。因而尋找高效低毒性抗肺腺癌藥物具有重要意義。

表5 抑制miR-219-5p的表達(dá)逆轉(zhuǎn)硝呋齊特對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用

注：與nifuroxazide +anti-miR-con組比較，#P<0.05

硝呋齊特可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡[12]。硝呋齊特還可誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，還能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞遷移及侵襲[13]。研究表明硝呋齊特可通過(guò)調(diào)控Stat3信號(hào)通路從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[14]。本研究結(jié)果顯示硝呋齊特處理肺腺癌細(xì)胞后，細(xì)胞增殖活力顯著降低，遷移與侵襲能力明顯受到抑制，細(xì)胞凋亡率顯著升高，說(shuō)明硝呋齊特可降低肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究表明Bax可通過(guò)激活線粒體途徑激活細(xì)胞凋亡執(zhí)行因子Caspase-3從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl2可抑制細(xì)胞凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示硝呋齊特可顯著促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞中Bax的表達(dá)而抑制Bcl2的表達(dá)，提示硝呋齊特可通過(guò)調(diào)控Bax、Bcl2表達(dá)從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

miR-219-5p在胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-219-5p表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖及侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]。研究表明miR-219-5p可通過(guò)抑制HMGA2表達(dá)從而抑制卵巢癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[17]。相關(guān)研究報(bào)道指出miR-219-5p可通過(guò)抑制BCL-2表達(dá)從而抑制惡性黑素瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[18]。本研究結(jié)果顯示硝呋齊特可明顯促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞中miR-219-5p的表達(dá)，抑制miR-219-5p表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)硝呋齊特對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的作用。提示硝呋齊特可通過(guò)上調(diào)miR-219-5p的表達(dá)而抑制肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，硝呋齊特可通過(guò)上調(diào)miR-219-5p的表達(dá)而降低肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，硝呋齊特可能成為治療肺腺癌的一種有研究前景的藥物。但關(guān)于硝呋齊特對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控作用及其對(duì)miR-219-5p下游靶基因表達(dá)的影響均需深入研究。