李華 徐鵬 王黎

急性有機磷農(nóng)藥中毒(acute organophosphorus pesticide poisoning，AOPP)占農(nóng)藥中毒80%以上，其造成的呼吸衰竭是致死的重要因素[1]。AOPP患者臨床救治手段包括洗胃、阿托品和膽堿酯酶復(fù)能劑等[2]，然而上述治療后患者仍可出現(xiàn)急性肺損傷表現(xiàn)，導(dǎo)致治療較為棘手。AOPP引起急性肺損傷的機制尚不完全清楚，有研究指出毒性氧自由基在有機磷中毒致肺損傷中起重要作用[3]。Nrf-2/ARE信號通路在多種氧化應(yīng)激性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用，該信號通路活化能誘導(dǎo)下游多種抗氧化酶形成，從而對抗ROS引發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)揮細胞保護作用[4]。因此，對AOPP所致的急性肺損傷，對Nrf-2/ARE信號通路進行調(diào)控，或許是一種行之有效的手段。大黃素為中藥大黃的主要有效單體，是一種蒽醌類衍生物，近年來研究發(fā)現(xiàn)大黃素尚具有抗氧化應(yīng)激、保護肺泡上皮的作用[5-7]。本研究通過灌喂氧樂果建立大鼠AOPP致急性肺損傷模型，檢測肺組織Nrf-2，HO-1及氧化應(yīng)激相關(guān)指標水平的的表達情況，并探討大黃素對急性肺損傷的保護作用及機制，現(xiàn)報告如下。

資料與方法

一、實驗動物

健康雄性SD大鼠54只，體質(zhì)量200～240g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號SCXK(京)2018-0023。

二、主要試劑與儀器

40%氧樂果(天津中化生物科技有限公司)，生理鹽水(山東華魯制藥有限公司)，大黃素(上海金穗生物科技有限公司)，水合氯醛(上海信裕生物科技有限公司)，兔抗鼠Nrf-2多克隆抗體(美國SANTA CRUZ公司)，兔抗鼠HO-1多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合的二抗(武漢博士德生物工程有限公司)，MDA、SOD、GSH-Px檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。倒置顯微鏡(Olympus公司)，全自動酶標免疫分析儀(Biotex公司)，蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)。

三、大鼠模型制備及分組

將所有54只大鼠于實驗室環(huán)境下給予適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機選取18只作為健康對照組，正常喂養(yǎng)，剩余36只大鼠用于建立有機磷農(nóng)藥中毒急性肺損傷模型。模型建立方式[8]：AOPP組和大黃素組采用40%氧樂果20 mg/kg灌喂，建立有機磷農(nóng)藥中毒急性肺損傷模型，健康對照組給予等量生理鹽水灌喂。大黃素組給予氧樂果灌喂后30min，經(jīng)胃灌入0.4 mg/kg大黃素(以1 mL生理鹽水溶解)。AOPP模型組及健康對照組大鼠均同時予以等體積生理鹽水。

四、樣本采集及處理

每組大鼠給藥后分三批(6、24、72 h)處死，每個時間點取6只大鼠，以10%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射將大鼠麻醉后固定，放血處死后嚴格無菌開胸取肺組織，留取右上肺組織，用生理鹽水沖洗表面血液并吸取表面水分，放入10%甲醛固定液中，常規(guī)包埋、切片，進行HE染色后鏡檢及讀片，取左肺組織置于-80℃冰箱凍存待檢。

五、大鼠肺濕/干質(zhì)量測定

取各時間點處死的大鼠肺組織，稱量其濕質(zhì)量(W)后，置烤箱中于70℃條件下烘烤24 h至恒重，稱量并記錄干質(zhì)量(D)，計算肺組織濕干質(zhì)量比(W/D)。

六、大鼠肺組織MDA，SOD、GSH-Px檢測

制備肺組織勻漿，離心后取上清液，使用比色法檢測肺組織中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性，操作嚴格按照試劑盒說明進行。

七、Western Blot檢測肺組織Nrf-2，HO-1蛋白表達

取左肺下葉肺組織，加入組織裂解液，勻漿，提取蛋白，采用BCA法對提取蛋白質(zhì)進行定量。取50μg樣品蛋白經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，使用5%脫脂牛奶室溫封閉2h后，分別加入Nrf-2，HO-1一抗和抗GAPDH抗體，4℃下孵育過夜，Tris-HCl緩沖液洗滌后加二抗室溫下孵育2h。使用ECL顯影劑顯影，采用Image J軟件進行灰度分析。計算Nrf-2，HO-1蛋白相對表達量。

八、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組大鼠行為表現(xiàn)

實驗大鼠在氧樂果染毒后10min內(nèi)表現(xiàn)出中毒反應(yīng)，出現(xiàn)四肢及全身肌肉震顫表現(xiàn)，并有進行性加重趨勢，同時有流涎、流淚癥狀、呼吸急促等表現(xiàn)，嚴重者出現(xiàn)肌無力或痙攣癥狀，部分有嘔意。大黃素干預(yù)組在染毒初若干小時內(nèi)與AOPP組具有類似的中毒表現(xiàn)，但在24 h后較AOPP組有明顯好轉(zhuǎn)，較先恢復(fù)活動，同時進食、進水行為均較好。所有氧樂果染毒大鼠在實驗觀察期內(nèi)無一死亡。

二、大鼠肺組織病理形態(tài)觀察

HE染色下可見健康對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡及間質(zhì)無明顯充血、滲出及炎癥細胞浸潤，具有完整的肺泡壁完整。AOPP組肺泡壁結(jié)構(gòu)被破壞，部分表現(xiàn)為不完整狀，同時伴有毛細血管充血，肺泡隔和泡腔內(nèi)出血及較多炎性細胞浸潤。大黃素組24、72 h時肺泡隔和泡腔內(nèi)出血較AOPP組明顯減輕，炎性細胞浸潤減少，肺泡結(jié)構(gòu)基本完整(見圖1)。

三、大鼠肺組織濕干質(zhì)量比(W/D)變化

與健康對照組相比，在灌喂氧樂果染毒后，AOPP組和大黃素組大鼠肺組織濕干質(zhì)量比(W/D)顯著增加(P<0.05)，大黃素組大鼠肺W/D在6h時與AOPP組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，在24 h和72 h時均顯著低于AOPP組(P<0.05)(見圖2)。

四、各組大鼠肺組織MDA、SOD、GSH-Px水平

圖1 各組大鼠肺組織病理變化(HE×200)

注：A：健康對照組；B：AOPP組；C：大黃素組24 h；D：大黃素組72 h

圖2 各組大鼠各時間點肺組織濕干質(zhì)量比(W/D)變化

注：與健康對照組：*P<0.05；與AOPP組比較：#P<0.05

與健康對照組比較，AOPP組各時間點MDA水平明顯升高(P<0.05)，大黃素組各時間點MDA水平較AOPP組顯著降低，在72 h時與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。AOPP組和大黃素組肺組織SOD、GSH-Px水平在各時間點較健康對照組顯著降低(P<0.05)，大黃素干預(yù)后，大黃素組各時間點SOD、GSH-Px水平明顯高于AOPP組(P<0.05)(見表1～3)。

表1 三組大鼠肺組織MDA水平

注：與健康對照組：*P<0.05；與AOPP模型組比較，#P<0.05

表2 三組大鼠肺組織SOD水平

注：與健康對照組：*P<0.05；與AOPP組比較：#P<0.05

表3 三組大鼠肺組織GSH-Px水平

注：與健康對照組：*P<0.05；與AOPP組比較：#P<0.05

五、各組大鼠肺組織Nrf-2，HO-1蛋白表達

與健康對照組比較，AOPP組和大黃素組24 h和72 h時Nrf-2，HO-1蛋白表達上調(diào)；與AOPP組比較，大黃素組24 h和72 h時Nrf-2，HO-1蛋白表達上調(diào)(均P<0.05)(見圖3)。

討 論

Nrf-2是機體內(nèi)關(guān)鍵的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)因子，與機體內(nèi)源性抗氧化損傷能力密切相關(guān)，其參與的信號通路在抗氧化應(yīng)激損傷中居于核心地位。正常生理狀態(tài)下，Nrf-2位于胞漿內(nèi)，與細胞質(zhì)接頭蛋白(Kelch-like ECH associating protein 1，Keap-1)結(jié)合并以復(fù)合物的形式存在，當受到氧化應(yīng)激信號刺激后，Nrf-2與Keap-1解偶聯(lián)，磷酸化后入核，并與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，進一步誘導(dǎo)其調(diào)控的靶基因表達HO-1，SOD和GSH-Px等抗氧化酶，從而對抗氧自由基引發(fā)的氧化應(yīng)激損傷，保護正常細胞免受其破壞[9]。在Nrf-2誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗氧化酶中，HO-1在機體受到氧化應(yīng)激刺激后最易被誘導(dǎo)表達。研究顯示Nrf-2缺乏可導(dǎo)致下游抗氧化酶的表達減少，并在動物模型中表現(xiàn)為對多種肺部疾病易感[10]。在脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷中，Nrf-2及其誘導(dǎo)的下游抗氧化酶可以發(fā)揮肺臟保護作用[11]，而Nrf-2的靶向缺失會導(dǎo)致新生小鼠肺氧化損傷，并損害肺發(fā)育[12]。

圖3 各組大鼠肺組織Nrf-2，HO-1蛋白表達

本研究中，采用40%氧樂果20 mg/kg灌喂建立有機磷農(nóng)藥中毒急性肺損傷模型。實驗中觀察到大鼠灌喂氧樂果后出現(xiàn)一系列有機磷中毒癥狀，如四肢及全身肌肉震顫并有逐步加重趨勢，同時有流涎、流淚癥狀、呼吸急促等。肺組織HE染色結(jié)果顯示，健康對照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，AOPP組HE染色病理形態(tài)符合急性肺損傷表現(xiàn)。另外，AOPP組氧樂果灌喂后，各時點肺組織濕干質(zhì)量比較健康對照組明顯增加，表明染毒后大鼠有明顯肺水腫表現(xiàn)，結(jié)合上述幾點可見本例中氧樂果致大鼠急性肺損傷模型構(gòu)建是成功的。

MDA由氧自由基攻擊細胞膜多不飽和脂肪酸產(chǎn)生，其能引起細胞膜結(jié)構(gòu)的變化，影響細胞膜通透性和流動性。有研究[13]發(fā)現(xiàn)在膿毒癥患者MDA升高與疾病嚴重程度及病死率密切相關(guān)。為抵抗氧化損傷，機體內(nèi)同時存在抗氧化酶系統(tǒng)，以SOD和GSH-Px等為主，SOD主要清除超氧陰離子，GSH-Px能迅速清除過氧化氫，兩者共同發(fā)揮作用，防止機體發(fā)生過氧化損傷[14-15]。本研究結(jié)果顯示，AOPP組在給予氧樂果染毒后，MDA水平較健康對照組明顯上升，SOD和GSH-Px活力顯著低于健康對照組，同時大黃素組MDA水平低于AOPP組，SOD和GSH-Px活力明顯高于AOPP組，表明大黃素在降低肺組織MDA生成同時，通過提高SOD和GSH-Px活力對抗氧化應(yīng)激損傷。本研究進一步通過蛋白印跡實驗對肺組織Nrf-2，HO-1蛋白進行檢測，結(jié)果顯示AOPP組和大黃素組24 h，72 h時Nrf-2和HO-1蛋白表達健康較對照組上調(diào)，提示氧樂果染毒后機體內(nèi)源性Nrf-2/ARE信號通路激活以對抗氧化應(yīng)激，表現(xiàn)為Nrf-2和HO-1蛋白表達上調(diào)，但隨著時間延長及氧化損傷加重，Nrf-2和HO-1蛋白表達可受到抑制，因此可以觀察到72 h時AOPP組HO-1蛋白表達較24 h時降低，但同時我們發(fā)現(xiàn)大黃素組24 h和72 h時Nrf-2，HO-1蛋白表達水平高于AOPP組(P<0.05)，說明大黃素可能通過調(diào)節(jié)Nrf-2/ARE信號通路促進了HO-1蛋白的表達。

綜上所述，在大鼠AOPP致肺損傷模型中，大黃素可能通過調(diào)節(jié)Nrf-2/ARE信號通路上調(diào)Nrf-2及其介導(dǎo)產(chǎn)生的HO-1、SOD、GSH-Px等表達，降低MDA水平發(fā)揮保護肺損傷作用，而關(guān)于大黃素調(diào)節(jié)Nrf-2/ARE信號通路的具體分子機制有待后續(xù)研究進一步闡明。