潘志鵬 王俊 段晨霞 陳嘉平 魏成功

肺氣腫是全球統(tǒng)一認(rèn)定的一大醫(yī)學(xué)難題，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的的研究顯示：該病主要是以肺泡實(shí)質(zhì)性損傷相關(guān)及進(jìn)一步的慢性氣道炎癥浸潤(rùn)有關(guān)[1]。目前臨床上認(rèn)為此過(guò)程為漸進(jìn)性加重，不可逆轉(zhuǎn)，同時(shí)亦缺乏明確有效的治療手段。人參皂甙Rb1(GS-R1)是人參皂甙中最主要的活性物質(zhì)，在損傷后具有抗炎作用[2]。目前GS-Rb1的細(xì)胞保護(hù)作用多集中在神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)方面有關(guān)[3-4]，而在呼吸系統(tǒng)方面涉及較少。線(xiàn)粒體自噬為細(xì)胞清除體內(nèi)受損的線(xiàn)粒體，緩解凋亡通路激活的保護(hù)性反應(yīng)。本研究通過(guò)肺氣腫形成后調(diào)控肺泡線(xiàn)粒體自噬功能，明確 GS-Rb1下調(diào)肺泡細(xì)胞凋亡的相關(guān)性，旨在探討GS-Rb1對(duì)肺氣腫治療作用的具體機(jī)制，為肺氣腫分子水平的治療奠定基礎(chǔ)。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器

40只體重150～200g的雄性SD大鼠由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)SCXK粵2011-0029)、豬胰蛋白酶(PPE)(Roche/美國(guó))、 GS-Rb1 (上海邦景/中國(guó))，氯喹 (Sigma/美國(guó))、anti-LC3-B(sigma/美國(guó))、anti-P62 (Abcam/英國(guó))、anti-PGC-1a(Novus Biologicals/美國(guó))、anti-mtTFA(Abcam/英國(guó))anti-Cyto C(Abcam/英國(guó))、anti-Bax(Abcam/英國(guó))、anti-Bcl-2(Santa Cruz/美國(guó))、anti-GAPDH(Abcam/英國(guó))、辣根酶標(biāo)記二抗 (江萊生物/中國(guó))、化學(xué)發(fā)光試劑盒(中山金橋生物科技/中國(guó))、所有ELISA試劑盒(武漢博士德生物/中國(guó))、蛋白電泳儀(Bio-Rad/美國(guó))、M200Pro免疫酶標(biāo)儀(TECAN/奧地利)。

二、 動(dòng)物模型制作

實(shí)驗(yàn)用大鼠在通風(fēng)房間內(nèi)按照光照:黑暗時(shí)間比例為12:12 h，給予水和食物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，動(dòng)物倫理已得到廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)V東中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的同意。將體積分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛以30 mg/kg給予大鼠腹腔注射麻醉滿(mǎn)意后，將大鼠固定于操作平臺(tái)，以頸部正中切口進(jìn)入，分離頸部肌肉暴露氣管并將4號(hào)注射器頭刺入以維持PPE(1u/g)的持續(xù)性滴入，最后再注入2mL空氣，以保證PPE完全進(jìn)入氣管，隨后縫合切口，再將大鼠立直旋轉(zhuǎn)，按摩雙側(cè)胸腔，以促進(jìn)PPE均勻分布于雙肺中。陰性對(duì)照組給予相同的手術(shù)過(guò)程，并注入等量的PBS。待動(dòng)物清醒后，放入原鼠籠中，以普通固體飲食，培養(yǎng)至12周至肺氣腫模型成功建立。

三、藥物的干預(yù)及分組

40只SD大鼠被隨機(jī)分為①陰性對(duì)照(Control)組、②GS-Rb1治療(PPE+ GS-Rb1)組、③GS-Rb+氯喹(CLQ)阻斷(PPE+GS-Rb1+CLQ)組、④肺氣腫組(PPE)組。①氣管給予PBS，②③均采用氣管內(nèi)給予PPE法制作肺氣腫模型，建模12周肺氣腫形成后，分別隔日腹腔注射GS-Rb1(40 mg/kg)及GS-Rb1(40 mg/kg)+CLQ(3 mg/kg)(按照Chen W等人的前期實(shí)驗(yàn)方法)[3]，④肺氣腫形成后不給予處理，各組均繼續(xù)飼養(yǎng)2周開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。根據(jù)我們之前預(yù)實(shí)驗(yàn)及前期實(shí)驗(yàn)顯示，為獲得P值在0.05水平，1-beta在0.20水平，根據(jù)Effect-Size計(jì)算出所需要的每組動(dòng)物數(shù)量為8(G-Power3.0)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們預(yù)定每組10只動(dòng)物，以防動(dòng)物意外死亡引起樣本量的不足。

四、ELFA法對(duì)支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中NAPDH氧化酶活性的測(cè)定。

大鼠稱(chēng)重，給予水合氯醛腹腔麻醉(具體同前)，按原切口進(jìn)入，無(wú)菌條件下暴露氣管與肺門(mén)，于右主支氣管處結(jié)扎右肺，以Hanks液5mL*6次行左肺灌洗，共計(jì)30毫升回收的BALF存入硅膠管中，離心后取上清液，分裝于試管內(nèi)，并在-20攝氏度保存。將上述上清液置入96孔熒光板中，再加入80ulPBS及6.25ul的1M的光澤精，再加入100uM的NAPDH后開(kāi)始發(fā)生反應(yīng)。采用多功能酶標(biāo)儀，在吸收波長(zhǎng)340nm，檢測(cè)速度30秒，時(shí)間為5 min。

五、BALF中總細(xì)胞數(shù)及中性粒細(xì)胞百分比計(jì)數(shù)

采用1.4部的BALF離心后的沉淀物，離心后加入生理鹽水中，定容至200 μL,混勻后置入細(xì)胞涂片離心機(jī)，1000轉(zhuǎn)/分*10 min，再1500轉(zhuǎn)/分*5 min，涂好的細(xì)胞涂片進(jìn)行瑞氏-吉姆薩染色，400*光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行炎細(xì)胞的分類(lèi)及計(jì)數(shù)

六、HE染色觀察肺氣腫病理學(xué)改變

將左肺組織標(biāo)本去除血管及結(jié)締組織，取部分肺組織，多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋，再經(jīng)蘇木素-伊紅染色(HE染色)病理切片，顯微鏡下觀察大鼠肺氣腫情況。采用肺泡平均內(nèi)襯間隔(MLI)，在MetaMorph/UIC/US病理圖像分析系統(tǒng)視野正中劃“十”字，計(jì)數(shù)通過(guò)該十字的肺泡間隔數(shù)(Ns)，測(cè)定十字線(xiàn)總長(zhǎng)度(L)，MLI=L/Ns，其數(shù)值反應(yīng)肺泡平均直徑，計(jì)數(shù)平均肺泡數(shù)，病理圖像分析系統(tǒng)下每個(gè)視野面積計(jì)數(shù)所含肺泡數(shù)，MAN=該視野肺泡數(shù)/該視野面積，其數(shù)值反應(yīng)平均肺泡密度。

七、免疫蛋白印記(WB)實(shí)驗(yàn)

將左肺剩余組織標(biāo)本用冰冷的PBS洗滌兩次；加入RIPA裂解緩沖液(Santa Cruze),含1%的蛋白酶抑制劑混合物。冰上勻漿、裂解10min,低溫離心12000轉(zhuǎn)/分*15 min，收集上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取30ug總蛋白，經(jīng)12%的SDS-PAGE Gel電泳分離，常規(guī)方法轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素(NC)膜上，5%脫脂牛奶-TBST封閉2 h，再分別將anti-LC3-B(1 ∶1000)、anti-P62(1 ∶1500)、anti-PGC-1a(1 ∶1000)、anti-mtTFA(1 ∶1000)anti-Cyto C(1 ∶1000)、anti-Bax(1 ∶1000)、anti-Bcl-2(1 ∶1000)、anti-GAPDH(1 ∶2500)加入封閉液，4攝氏度輕搖過(guò)夜，回收一抗液體，給予TBST溶液洗滌NC膜，加入辣根酶標(biāo)記二抗與封閉液按1 ∶2000的比例混合液，37攝氏度下，孵育1 h，再采用化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行發(fā)光顯影。采用Image J 1.36b軟件下行吸光度分析，以Control組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值100%,其余組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與之比較，其它蛋白以吸光度值/GAPDH為相對(duì)含量，以Control組目標(biāo)蛋白/GAPDH為100%，其余組與之進(jìn)行比較。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、GS-Rb1可明顯降低BALF中NAPDH氧化酶的活性，并且可被自噬抑制劑所抑制。

PPE+GS-Rb1組的NAPDH氧化酶活性盡管較Control組升高(P<0.05)，但相對(duì)于PPE組卻明顯降低(P<0.05)，具有治療效應(yīng)。采用自噬抑制劑CLQ后，此種效應(yīng)可被明顯抑制(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 NAPDH氧化酶活性的變化(n=10)

各實(shí)驗(yàn)組與Control組比較：*P<0.05，PPE+GS-Rb1+CLQ組與PPE+GS-Rb1組比較：#P<0.05,PPE+GS-Rb1與PPE比較：▽P<0.05。

二、GS-Rb1可明顯降低BALF中細(xì)胞數(shù)及中性粒細(xì)胞百分比，且可被自噬抑制劑所抑制。

給予GS-Rb1治療后，BALF中白細(xì)胞數(shù)及中性粒細(xì)胞的百分比均較PPE組明顯降低(P<0.05)，與Control組無(wú)明顯差異(P>0.05)。但CLQ可明顯降低GS-Rb1的此種保護(hù)效應(yīng)(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 BALF中白細(xì)胞數(shù)及中性粒細(xì)胞的百分比

各實(shí)驗(yàn)組與Control組比較:*P<0.05，PPE+GS-Rb1+CLQ組與PPE+GS-Rb1組比較:#P<0.05,PPE+GS-Rb1與PPE比較:▽P<0.05。

三、GS-Rb1可明顯緩解肺氣腫的病理學(xué)改變，且可被自噬抑制劑所抑制。

PPE組大鼠肺泡腔融合、肺泡間隔斷裂、氣道上皮細(xì)胞排列紊亂、局部上皮細(xì)胞增生、管壁粗厚、周?chē)橛醒装Y細(xì)胞浸潤(rùn)。在給予GS-Rb1治療后，肺泡腔擴(kuò)大程度明顯好轉(zhuǎn)，肺泡間隔增寬減少，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但在給予自噬抑制劑CLQ后，可明顯阻斷GS-Rb1的此種治療作用。PPE+GS-Rb1+CLQ組MLI明顯高于Control及PPE+GS-Rb1組(P<0.05)，而MAN明顯低于Control及GS-Rb1治療組(P<0.05)(見(jiàn)圖1、表3)。

圖1 肺組織病理學(xué)切片 ×200

表3 各組大鼠MLI/MAN的變化

各實(shí)驗(yàn)組與Control組比較：*P<0.05， PPE+GS-Rb1+CLQ組與PPE+GS-Rb1組比較：#P<0.05,PPE+GS-Rb1與PPE比較：▽P<0.05。

四、GS-Rb1使用后可明顯上調(diào)肺泡細(xì)胞的自噬功能。

相對(duì)于PPE組，GS-Rb1治療后自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例明顯升高，P62表達(dá)明顯降低(P<0.05)。同時(shí)自噬抑制劑CLQ則可明顯抑制GS-Rb1的此種效應(yīng)(見(jiàn)圖2)。

圖2 自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)(n=10)

各實(shí)驗(yàn)組與Control組比較：*P<0.05，PPE+GS-Rb1+CLQ組與PPE+GS-Rb1組比較：#P<0.05, PPE+GS-Rb1與PPE比較：▽P<0.05。

五、GS-Rb1可明顯上調(diào)肺泡細(xì)胞線(xiàn)粒體功能相關(guān)蛋白PGC-1a、mtTFA表達(dá)，并且和自噬有關(guān)。

GS-Rb1可明顯上調(diào)損傷后肺泡細(xì)胞中PGC-1a及mtTFA(P<0.05)，其中PGC-1a與Control組無(wú)明顯差異(P>0.05)，同時(shí)此種效應(yīng)可被CLQ明顯的抑制((P<0.05)(見(jiàn)圖2)。

六、GS-Rb1可通過(guò)激活自噬上調(diào)凋亡抑制因子Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)凋亡促進(jìn)因子Bax及凋亡標(biāo)志蛋白Cyto C的表達(dá)。

圖3 PGC-1a及mtTFA表達(dá)的變化(n=10)

*各實(shí)驗(yàn)組與Control組比較：*P<0.05， PPE+GS-Rb1+CLQ組與PPE+GS-Rb1組比較：#P<0.05,PPE+GS-Rb1與PPE比較：▽P<0.05。

GS-Rb1治療組較PPE組可明顯降低促凋亡蛋白Cyto C, Bax及升高凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)(P<0.05)，但給予自噬抑制劑CLQ后，則可明顯抑制GS-Rb1的此種效應(yīng)(P<0.05)(見(jiàn)圖4)。

討 論

隨著現(xiàn)在大氣環(huán)境的惡化，肺氣腫的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，成為危害人類(lèi)健康的主要疾病之一。目前對(duì)于肺氣腫的發(fā)病機(jī)制仍不完全明確，普遍認(rèn)為是肺泡細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)的增強(qiáng)及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為主，呈不可逆轉(zhuǎn)性，且目前臨床上對(duì)此缺乏有效的治療藥物。

圖4 凋亡蛋白Cyto C, Bax及凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)(n=10)

各實(shí)驗(yàn)組與Control組比較：*P<0.05， PPE+GS-Rb1+CLQ組與PPE+GS-Rb1組比較：#P<0.05,PPE+GS-Rb1與PPE比較：▽P<0.05。

人參皂甙(GS)已被證明是人參的最主要的活性成分。目前有大量的實(shí)驗(yàn)證明，GS具有抗炎、抗氧化及降低脂質(zhì)類(lèi)代謝產(chǎn)物的作用[5]。Rb1則作為GS中含量最為主要的成分，而得到越來(lái)越多的重視。目前對(duì)于GS-Rb1研究注意涉及于神經(jīng)損傷后修復(fù)方面，GS-Rb1具有抑制氧化應(yīng)激因子NOX1、NOX2、NOX4、NAPDH的功能[3]。但以上的研究尚未對(duì)GS-Rb1參與調(diào)節(jié)的損傷因子的具體機(jī)制進(jìn)行深入分析。

目前針對(duì)于GS-Rb1的研究多集中在神經(jīng)損傷的疾病中。有研究顯示，GS-Rb1對(duì)腦損傷的緩解可能和其對(duì)Cx40的上調(diào)的抑制有關(guān)[6]，而Cx40的異常升高則與線(xiàn)粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)紊亂引起的氧化應(yīng)激的增強(qiáng)密切相關(guān)[7]。而在本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)诮o予大鼠GS-Rb1后，可顯著抑制肺泡細(xì)胞中NAPDH氧化酶的活性，降低炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，同時(shí)緩解肺氣腫的病理性損傷。因此本實(shí)驗(yàn)也明確了GS-Rb1對(duì)肺泡細(xì)胞的保護(hù)作用與線(xiàn)粒體損傷后修復(fù)有關(guān)，這也為我們下一步深入探討GS-Rb1與肺泡細(xì)胞線(xiàn)粒體自噬相關(guān)性奠定了基礎(chǔ)。

自噬是存在與真核細(xì)胞中的生命現(xiàn)象，在正常細(xì)胞中自噬活性較低。而大量的研究則顯示，自噬與損傷性疾病密切相關(guān)。當(dāng)細(xì)胞處于組織損傷、缺血缺氧所導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等情況下，自噬通過(guò)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白依賴(lài)性通路(mTOR)被激活，從而通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)，以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。線(xiàn)粒體自噬是目前研究的較多的一種自噬形式，是選擇性清除受損的線(xiàn)粒體的過(guò)程。線(xiàn)粒體在損傷后可因：(1)ROS過(guò)度累積而導(dǎo)致自身DNA損傷，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)及功能的紊亂；(2)ATP減少所致的鈣超載；(3)線(xiàn)粒體膜通透性改變，其膜間隙的細(xì)胞色素C及促凋亡蛋白釋放入胞漿，引起細(xì)胞凋亡。近來(lái)的研究顯示，自噬早于凋亡的出現(xiàn)，并可通過(guò)清除受損的線(xiàn)粒體而抑制凋亡[8]。近年來(lái)的研究也顯示，氧化應(yīng)激促進(jìn)因子 Cx40的清除也與自噬明確相關(guān)[9]，這提示，線(xiàn)粒體自噬可能通過(guò)抑制氧化應(yīng)激下游的炎性產(chǎn)物的增多而起到細(xì)胞保護(hù)作用，在本實(shí)驗(yàn)中，我們使用GS-Rb1后，可明顯上調(diào)肺泡細(xì)胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例、下調(diào)P62的表達(dá)、抑制線(xiàn)粒體功能蛋白PGC-1a及mtTFA及凋亡抑制蛋白Bcl-2的下調(diào)，而凋亡促進(jìn)因子Bax及Cyto C的表達(dá)的上調(diào)受到明顯的抑制，而自噬抑制劑CLQ則可明顯的抑制此種效應(yīng)，這證明GS-Rb1可能通過(guò)增強(qiáng)線(xiàn)粒體自噬的作用，從而抑制肺泡細(xì)胞的凋亡。

結(jié)合上述的情況，我們認(rèn)為GS-Rb1肺泡保護(hù)效應(yīng)可能與線(xiàn)粒體自噬的激活、線(xiàn)粒體功能的保護(hù)、凋亡及氧化應(yīng)激抑制有關(guān)。在此基礎(chǔ)上，我們下一步將注重于GS-Rb1對(duì)自噬相關(guān)基因及信號(hào)傳導(dǎo)通路的的研究，為進(jìn)一步了解GS-Rb1通過(guò)自噬參與細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制及為肺氣腫的的基因靶點(diǎn)治療奠定基礎(chǔ)。