胡宇晴 劉萍 慕彰磊 張建中

北京大學人民醫(yī)院皮膚科 100044

特應(yīng)性皮炎（AD）是一種慢性炎癥性瘙癢性皮膚病，多見于兒童和成人，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，其病因和發(fā)病機制尚未完全闡明，主要與遺傳、皮膚屏障破壞、微生物、免疫失調(diào)、環(huán)境和精神因素等有關(guān)［1］。芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）是一種受配體調(diào)控的胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子，可影響多種基因的轉(zhuǎn)錄及表達，具有誘導(dǎo)多種重要的外源性細胞色素P450 酶作用，廣泛存在于人體各組織細胞。近年研究表明，AhR 不僅介導(dǎo)各種環(huán)境毒物如多環(huán)芳烴等的毒性作用，還參與許多重要的生物學過程，如細胞增殖和分化、免疫調(diào)節(jié)、機體生長發(fā)育及生理穩(wěn)態(tài)的維持。AhR 的外源性配體、可作為外來環(huán)境污染物的多環(huán)芳烴已被證實可誘發(fā)接觸性皮炎、特應(yīng)性皮炎、鼻炎和哮喘等變態(tài)反應(yīng)性疾病［2］，推測 AhR 及其信號通路可能對 AD 的發(fā)病發(fā)揮作用。目前尚未有AhR 及其下游分子在AD 患者外周血及皮損組織中的相關(guān)研究。我們通過檢測AD 患者血清、外周血單個核細胞（PBMC）及皮損中AhR 及其下游分子細胞色素P4501A（CYP1A1）、CYP1B1、芳 香 烴 受 體 抑 制 因 子（AHRR）和芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白（ARNT）的表達水平，探討其在AD發(fā)病中的作用及臨床意義。

對象與方法

一、病例資料

收集2018 年8-11 月在北京大學人民醫(yī)院皮膚科門診就診的AD 患者29 例，均符合1980 年Hanifin 和 Rajka 制定的 AD 診斷標準［3］以及 2016 年提出的特應(yīng)性皮炎的“中國標準”［4］?；颊呔窗榘l(fā)其他炎癥性皮膚?。ㄈ玢y屑病、白癜風等）及其他免疫性疾病，2 周內(nèi)未曾服用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑治療。其中男18例，女11例，年齡12 ～80（43.7±18.3）歲。健康對照組17例，均為健康志愿者，其中女10 例，男 7 例，年齡19 ～ 76（39.4 ± 14.4）歲。兩組受試者在年齡（t=0.522，P=0.605）和性別（χ2=1.885，P=0.170）方面差異均無統(tǒng)計學意義。其中27 例AD 患者由皮膚科醫(yī)生進行病情嚴重程度評分，濕疹面積及嚴重程度指數(shù)（EASI）評分為18.7±15.5。取受試者外周血5 ml，其中2 ml 離心后分離血漿置于-80 ℃冰箱保存，用于細胞因子檢測，3 ml經(jīng)密度梯度離心獲得PBMC，用于檢測AhR 及其下游分子。在病例組中選取19 例AD 患者皮損組織蠟塊，另選取21 例色素痣切除標本的正常皮膚組織作為正常皮膚對照進行AhR 免疫組化檢測。正常皮膚組中，女8 例，男9 例，年齡（40.9 ± 10.6）歲，AD 組和正常皮膚組年齡（t= 0.533，P= 0.630）、性別（χ2=1.685，P=0.311）差異無統(tǒng)計學意義。本研究通過北京大學人民醫(yī)院倫理委員會審批（批件號No.2018PHA033），所有受試者均簽署知情同意書。

二、材料

細胞總RNA 提取試劑盒產(chǎn)自德國Qiagen 公司，cDNA 合成試劑盒和SYBR Green PCR 試劑盒產(chǎn)自北京天根生化科技有限公司，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，人白細胞介素（IL）1β、IL?6、TNF（腫瘤壞死因子）α、IL?4、IL?22 和 AhR 的ELISA 檢測試劑盒產(chǎn)自美國eBioscience 公司，免疫組化試劑盒產(chǎn)自武漢塞維爾生物科技有限公司，兔抗人AhR 抗體產(chǎn)自美國Abcam 公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG產(chǎn)自上海碧云天生物公司。

三、方法

1.PBMC 分離：取 29 例患者及 17 例健康對照乙二胺四乙酸抗凝血3ml，加入淋巴細胞分離液，2 000 ×g離心 20 min，吸出 PBMC，加入 10 ml PBS混勻，3 000 ×g離心 10 min，棄上清液，重復(fù)洗滌3 次，棄上清，加入 600 μl RNA 提取細胞裂解液充分吹打混勻后放入-80 ℃冰箱，備用。

2.RNA提取和濃度測定：使用總RNA提取試劑盒按照操作說明書提取PBMC總RNA，測定總RNA純度，A260/A280比值介于1.8 ～2.1之間，表示RNA純度較好，可用于后續(xù)實驗。20 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的外周血總RNA的完整性，在UV1凝膠成像系統(tǒng)下可以觀察到18S 和28S 兩條條帶，并且28S 的寬度約是 18S 的 1.5 ～ 2.0 倍，提示實驗所提取的總RNA完整性較好，符合后續(xù)實驗的要求。

3.實時 PCR（RT?PCR）檢測 PBMC 中 AhR、CYP1A1、AHRR 和 ARNT mRNA 的 表 達 ：使 用cDNA合成試劑盒，按照操作說明冰上配制20 μl反應(yīng)液，42 ℃水浴15 min，95 ℃水浴5 min，合成cDNA第1 鏈后迅速置于冰上，使用SYBR Green PCR 儀（美國BioRad 公司）檢測 AhR、CYP1A1、AHRR 和ARNT mRNA 的表達，以β肌動蛋白為內(nèi)參，引物序列參見表1。反應(yīng)條件：95 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，60 ℃15 s，72 ℃ 15 s，共40個循環(huán)，不加引物或模板的擴增體系作為陰性對照。PCR 產(chǎn)物以20 g/L 瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠顯色，用UV1 凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳的位置和條帶情況。以2-△△Ct表示目的基因的相對表達量，ΔCt＝待檢基因Ct 值-β 肌動蛋白平均Ct值。

4.ELISA 檢測血清細胞因子：按照試劑盒說明書檢測受試者血清IL?1β、IL?6、TNF?α、IL?4、IL?22和AhR水平。根據(jù)A450值，計算細胞因子濃度。

5.免疫組化檢測皮膚組織中AhR蛋白表達：連續(xù)切取5 mm厚石蠟切片，二甲苯脫蠟2次，PBS洗滌3次，3%牛血清白蛋白封閉液室溫封閉30 min，加入AhR抗體（1∶100）4 ℃過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶1 000）室溫孵育50 min，采用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液進行免疫組化染色。結(jié)果判定：顯微鏡下觀察，以角質(zhì)形成細胞胞質(zhì)及胞膜染成棕黃色為陽性。應(yīng)用Image pro plus（IPP）顯 微 圖 像 分 析 系 統(tǒng)（University of California，USA）評估切片著色強度，獲得AhR平均吸光度（A值）。

四、統(tǒng)計學分析

結(jié)果

一、AD組與健康對照組PBMC中AhR及其下游分子mRNA的表達

見圖1。與健康對照組相比，AD 組PBMC 中AhR mRNA（1.572 ± 0.392 比 1.000 ± 0.173，t=6.819，P= 0.007）、AHRR mRNA（2.402 ± 1.716 比1.000 ± 0.788，t=3.722，P=0.039）、CYP1A1 mRNA（2.258 ± 1.598 比 1.000 ± 0.796，t= 3.400，P=0.002）均顯著增高，但ARNT mRNA（1.383 ± 0.842比 1.000 ± 0.586，t= 1.653，P= 0.105）與健康對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。

二、AD患者血清中AhR與細胞因子的表達

AD 組和健康對照組血清AhR 水平分別為（41.26 ± 4.52）pmol/L 和（33.73 ± 2.49）pmol/L（t=6.507，P＜0.001），AD組血清中IL?1β、IL?6、TNF?α、IL?4、IL?22 水平分別為（49.4 ± 13.2）、（36.3 ± 7.5）、（51.5 ± 13.8）、（34.3 ± 9.2）和（19.2 ± 8.7）μg/L。

三、AD組AhR mRNA及血清水平與EASI指數(shù)的相關(guān)性

見 圖2。 AD 組 PBMC 中 AhR mRNA 水 平 與EASI 評分呈正相關(guān)（r=0.448，P=0.019），但AD 組血清 AhR 水平（r= 0.135，P= 0.529）及 PBMC 中CYP1A1 mRNA（r=0.063，P=0.755）、AHRR mRNA（r= 0.033，P= 0.869）、ARNT mRNA（r= 0.119，P=0.553）水平與EASI評分均無統(tǒng)計學相關(guān)性。

表1 實時PCR所用引物序列

圖1 特應(yīng)性皮炎（AD）組（29例）與健康對照組（17例）外周血單個核細胞中AhR、CYP1A1、AHRR、ARNT mRNA 的表達 AhR：芳香烴受體；CYP1A1：細胞色素P4501A；AHRR：芳香烴受體抑制因子；ARNT：芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白

圖2 29 例特應(yīng)性皮炎患者外周血單個核細胞中芳香烴受體（AhR）mRNA與濕疹面積及嚴重程度指數(shù)（EASI）相關(guān)性分析

四、AD組PBMC中AhR mRNA與血清細胞因子的相關(guān)性

應(yīng) 用 Pearson 檢驗分 析 AD 組 PBMC 中 AhR、CYP1A1、AHRR和ARNT mRNA表達與血清中細胞因子（IL?1β、IL?6、TNF?α、IL?4、IL?22）的相關(guān)性，結(jié)果顯示 AD 組 PBMC 中 AHRR mRNA 與血清 IL?1β水平呈正相關(guān)（r=0.467，P=0.021），AhR mRNA 與血清IL?6 水平呈正相關(guān)（r=0.377，P=0.046），AhR及其下游信號分子mRNA表達與其他血清細胞因子水平之間均無統(tǒng)計學相關(guān)性（均P＞0.05）。見表2。

五、AD組和正常皮膚對照組組織中AhR免疫組化結(jié)果

AD 組皮損和對照組皮膚中表皮角質(zhì)形成細胞均不同程度表達AhR，AhR在正常皮膚中主要分布于表皮和真皮中上層（圖3A），在AD 皮損中分布于表皮和真皮全層，并且在顆粒層染色較深（圖3B、3C）。AhR 在正常皮膚中呈低中度表達（0.087±0.017），在AD 皮損中高表達（0.191± 0.041），兩組AhR 吸光度差異有統(tǒng)計學意義（t=10.036，P＜0.001）。

討論

AhR 又稱二噁英受體，是由806 個氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄因子，是細胞信號通路的調(diào)節(jié)子，其活化依賴配體的存在，屬于堿性雙螺旋環(huán)結(jié)構(gòu)家族。在沒有配體存在時，AhR 與其伴侶蛋白（熱休克蛋白90和乙肝病毒X相關(guān)蛋白2）結(jié)合形成復(fù)合體，位于細胞質(zhì)，處于失活狀態(tài)；當配體（如多環(huán)芳香烴類、鹵代芳香烴類、吲哚類及類黃酮類）存在時，伴侶蛋白從AhR解離，AhR與其激動劑結(jié)合后形成的復(fù)合體可易位到細胞核內(nèi)，與ARNT 結(jié)合形成AhR/ARNT異二聚體，從而啟動靶基因轉(zhuǎn)錄，編碼外源性代謝酶，如 CYP1A1 和 IL?1β 等，誘導(dǎo)相關(guān)基因表達［5］。其中CYP1A1 可參與外環(huán)境污染物及藥物代謝過程，是目前研究最多的AhR 的應(yīng)答基因；AHRR 是AhR 抑制因子，也是一種負反饋轉(zhuǎn)錄因子。AHRR和CYP1A1產(chǎn)生的應(yīng)答均依賴于AhR的活化［6］。

近年有研究表明，AhR 信號通路對維持皮膚屏障的完整和調(diào)節(jié)皮膚免疫具有重要作用，改變AhR信號通路產(chǎn)生的生物學效應(yīng)不同，這取決于皮膚本身的炎癥狀態(tài)及配體的來源［2］。對于有炎癥性疾病（如銀屑病、AD、接觸性皮炎和白癜風）的皮膚組織，通過配體活化AhR可抑制前炎癥反應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子如核因子（NF）?κB 和 IL?1β［6］。AhR 活化還可上調(diào)角質(zhì)形成細胞內(nèi)聚絲蛋白的表達，從而有利于皮膚屏障的完整性，減少外源性過敏原的刺激［7］。此外，AhR 受體激動劑如 tapinarof 已被證實可抑制前炎癥細胞因子如γ 干擾素、IL?2 和 TNF?α的表達，還可抑制PBMC 向炎癥反應(yīng)部位的遷移和浸潤，改善AD 患者的皮疹及瘙癢［8］。但還有研究表明，AhR 可介導(dǎo)各種皮膚疾病的發(fā)生，并且許多炎癥細胞因子及其受體都具有AhR 序列的結(jié)合位點，AhR 的外源性配體如多環(huán)芳烴、二噁英和紫外線等已被多項研究證明可對皮膚組織產(chǎn)生多種有害的影響，如誘發(fā)皮膚腫瘤、接觸性皮炎和氯痤瘡等［2］。Kim 等［9］發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者皮損組織中 AhR mRNA 表達顯著高于健康對照組，并且通過免疫組化發(fā)現(xiàn)銀屑病皮損組織表皮中AhR 和ARNT 均有表達，且AhR 的表達高于健康對照組，但二者表皮中ARNT 的表達無顯著差異。本研究在mRNA 水平上證實 AD 患者 PBMC 中 AhR、CYP1A1、AHRR和ARNT 的表達均高于健康對照組，同時還發(fā)現(xiàn)AD 患者 PBMC 中 AhR mRNA 的表達與 AD 嚴重 程度呈正相關(guān)，AD患者皮損組織中AhR表達增高，提示AhR 及其信號通路很可能參與AD 的進展，并且AhR的表達水平可以作為判斷AD患者病情嚴重程度的指標之一。AhR及其信號通路在AD中的具體作用機制尚不完全清楚，其信號通路產(chǎn)生的生物學效應(yīng)為何不同，仍需進一步研究。

表2 29例特應(yīng)性皮炎患者外周血單個核細胞中AhR、CYP1A1、AHRR和ARNT mRNA表達與部分細胞因子血清水平的相關(guān)性分析

圖3 特應(yīng)性皮炎（AD）患者皮損和色素痣患者正常皮膚組織中芳香烴受體（AhR）的表達（免疫組化；3A、3B：×40，3C：×200） 3A：AhR在正常皮膚組織中低度或中度表達，主要表達于表皮和真皮淺層；3B、3C：AhR在AD皮損中呈中度至重度表達，分布于表皮和真皮全層，并在顆粒層染色加深

許多炎癥細胞因子及其受體、受體相關(guān)蛋白基因的增強子或者啟動子區(qū)域都具有AhR結(jié)合序列，因此，AhR 能直接或間接調(diào)控炎癥細胞因子的產(chǎn)生和分泌。一方面，AhR 各種配體能增加部分炎癥因子的表達，在多種細胞系中過表達AhR可通過增強細胞NF?κB 和絲裂原活化蛋白激酶促進多種細胞因子如 IL?6、IL?8 和 TNF?α 等的產(chǎn)生［10］。另一方面，AhR 在生理情況下對炎癥反應(yīng)具有負性調(diào)控作用，通過部分途徑激活A(yù)hR 可抑制前炎癥反應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，如 γ 干擾素、IL?2 和 IL?1β。本研究顯示，AhR mRNA 與 IL?6 呈正相關(guān)，與其他細胞因子均無相關(guān)性。Kolasa 等［11］研究表明，配體激活的 AhR 可增強 NF?κB 復(fù)合物的 DNA 結(jié)合活性，作用于 IL?6 啟動子，從而增強 IL?6 的表達，本研究結(jié)果與既往文獻一致。我們還發(fā)現(xiàn)，AHRR mRNA 與IL?1β 呈正相關(guān)，說明 AhR 的下游抑制分子可能誘導(dǎo)IL?1β分泌，然而具體機制，仍有待進一步研究。

綜上，我們發(fā)現(xiàn)AD 患者血清、PBMC 和皮損組織中AhR 較對照組表達增高，PBMC 中AHRR 和CYP1A1 的表達顯著高于健康對照組，且AD 患者PBMC 中 AhR mRNA 表達與血清 IL?6 水平和疾病嚴重程度呈正相關(guān)。本研究進一步闡明了AD的發(fā)病機制，為今后深入研究AhR 信號通路在AD 發(fā)病機制中的作用和以AhR 為作用靶點的治療都具有非常重要的臨床價值。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突