尹愛(ài)國(guó)，曾霞，程水明，岳茂峰，彭舒

（廣東石油化工學(xué)院廣東高校果蔬加工與貯藏工程技術(shù)開(kāi)發(fā)中心，廣東 茂名 525000）

桑椹（Morus alba L.）是?？疲∕oraceae）桑屬（Morus）落葉喬木桑樹(shù)的果實(shí)，有黑桑椹和白桑椹類型[1]。桑椹鮮果可食用，味甜汁多，富含多種人體所必須營(yíng)養(yǎng)成分（有機(jī)酸、抗氧化作用的VE和VC、類黃酮類的花色苷、白藜蘆醇、多種礦物質(zhì)元素等），是人們常食的水果之一，且具一定藥用價(jià)值，是國(guó)家頒布的“藥食兩用”水果之一[1]。桑椹具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力、調(diào)節(jié)血脂、抗輻射等作用，有益于延緩機(jī)體衰老，有望開(kāi)發(fā)成降脂保健功能食品或輔助治療藥物[2-5]，應(yīng)用前景好。目前對(duì)桑椹研究主要聚焦在黑桑椹，主要是利用黑桑椹加工成果酒、果醬等產(chǎn)品[6-9]。白桑椹雖然花色苷含量低，但其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不低于黑桑椹[10]，其果實(shí)碩大，果肉細(xì)膩，濃甜如蜜，食用性更強(qiáng)[11]，但因白桑椹為天然漿果，皮薄，水分和糖分多，季節(jié)性強(qiáng)，鮮果難儲(chǔ)藏，有關(guān)白桑椹的相關(guān)研究及加工利用報(bào)道極少，深入研究與開(kāi)發(fā)白桑椹資源就顯得十分必要與迫切。

桑椹酒是近些年來(lái)新興起的保健果酒，酒體富含氨基酸、多酚、有機(jī)酸等成分[12-13]，既可充分開(kāi)發(fā)利用現(xiàn)有的桑椹資源，提升桑椹種植業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，又可增加酒類品種，豐富果酒市場(chǎng)。目前，對(duì)桑椹酒的研究主要集中在黑桑椹發(fā)酵工藝和營(yíng)養(yǎng)分析等方面，而對(duì)白桑椹酒發(fā)酵研究近乎空白[14-16]。為利用白桑椹營(yíng)養(yǎng)及資源優(yōu)勢(shì)，延長(zhǎng)蠶桑產(chǎn)業(yè)鏈，促進(jìn)蠶桑產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)，本研究從果汁體積比、發(fā)酵溫度、糖度、SO2濃度、發(fā)酵液pH 值及接種量等方面探討它們對(duì)白桑椹與檸檬果酒發(fā)酵的影響，通過(guò)單因素試驗(yàn)，采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化果酒發(fā)酵工藝參數(shù)，釀出口感純正、風(fēng)味獨(dú)特的白桑椹檸檬果酒，為白桑椹資源綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

白桑椹：品名“白玉王”，茂名市蠶業(yè)技術(shù)推廣中心；檸檬：品種“Eureka”，市售；SY 型酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；白砂糖：市售。

1.2 儀器設(shè)備

PAL-1 數(shù)顯糖度計(jì)：日本ATAGO 愛(ài)宕公司；ZYBIO-5L 發(fā)酵罐：上海紫裕生物科技有限公司；PHS-3C pH 計(jì)：上海雷磁儀器廠；BSP-250 生化培養(yǎng)箱：長(zhǎng)春博迅生物技術(shù)有限責(zé)任公司；SY-2 型錯(cuò)流膜過(guò)濾器：紹興海納膜技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 白桑椹檸檬酒釀造工藝流程

白桑葚檸檬果酒釀造的主要工藝流程如下。

操作要點(diǎn)：

1）挑選原料：摘除未成熟果，挑取顆粒飽滿、無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)腐爛的成熟果實(shí)作為釀酒用原材料。

2）榨汁：白桑椹及檸檬用清水沖洗后，分別榨汁，果汁備用。

3）調(diào)配果汁：經(jīng)處理后的果汁按設(shè)計(jì)比例混合后，用食用級(jí)白砂糖及檸檬酸調(diào)整復(fù)合果汁的起始糖度和pH 值。

4）殺菌：在榨汁后的白桑椹汁和檸檬汁中分別加偏重亞硫酸鉀，蓋罐密封放置24 h。

5）酵母活化：取發(fā)酵用酵母于100 mL2%糖水中，搖床培養(yǎng)（37 ℃，1 h），備用。

6）接種：將活化酵母按設(shè)計(jì)量加入到調(diào)配好的復(fù)合果汁中。

7）主發(fā)酵：將接種后的發(fā)酵液置于不同設(shè)計(jì)溫度下發(fā)酵7 d。定期取樣測(cè)糖含量，依據(jù)糖含量變化確定發(fā)酵進(jìn)程。

8）過(guò)濾：主發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液用專用濾網(wǎng)進(jìn)行分離，留濾液。

9）密封陳釀：分離后酒液采用密封、避光陳釀，為防止酒液氧化，盡量滿罐封藏，減少酒體和空氣接觸，4 ℃陳釀 30 d。

10）過(guò)濾除菌：陳釀后果酒采用錯(cuò)流膜過(guò)濾器過(guò)濾，留濾液，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

11）灌裝：過(guò)濾除菌酒液在無(wú)菌條件下灌裝。

1.3.2 發(fā)酵工藝參數(shù)篩選的單因素試驗(yàn)

設(shè)計(jì)白桑椹與檸檬汁比（白桑椹100%，檸檬為0～10%，按 2 %幅度遞增）、起始糖度（16 %～26 %，按2 %幅度遞增）、起始pH 值（2.7～4.2，按0.3 幅度遞增）、主發(fā)酵溫度（15 ℃～30 ℃，按 5 ℃幅度遞增）；SO2濃度（0 mg/L ～75 mg/L，按 15 mg/L 幅度遞增）及接種量（0.2%～2.2%/V/活化酵母，按0.4%幅度遞增）為考察因素，每24 h 取樣，測(cè)發(fā)酵液中總糖含量，依據(jù)總糖含量變化確定發(fā)酵進(jìn)程。陳釀結(jié)束后，測(cè)發(fā)酵液總糖含量、酒精度、揮發(fā)酸、總酸，探討因素變化對(duì)白桑椹檸檬果酒發(fā)酵程度及風(fēng)味影響大小。

1.3.3 基本指標(biāo)測(cè)定方法

總酸參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測(cè)定》用酸堿滴定法測(cè)量[11]；pH 值參考GB10468-1989《水果和蔬菜產(chǎn)品pH 值的測(cè)定方法》用電位差法測(cè)定；酒精度、揮發(fā)酸（以乙酸計(jì)）參考GB/T15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》用酸堿滴定法測(cè)定；總糖采用PAL-1 數(shù)顯糖度計(jì)直接測(cè)定；微生物通過(guò)GB 4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》和GB 4789.3-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》中的MPN 法分別進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 感官評(píng)定

參考文獻(xiàn)[1]、[17]方法進(jìn)行，感官評(píng)定小組由10人組成，成員均經(jīng)過(guò)培訓(xùn)（男女各半），評(píng)價(jià)項(xiàng)目指標(biāo)及描述如表1[18]所列。評(píng)價(jià)小組在品嘗前需嗅聞待評(píng)測(cè)酒樣，每酒樣（20 mL）在20 ℃下被隨機(jī)編號(hào)和品嘗，每個(gè)酒樣平行測(cè)定3 次，評(píng)價(jià)成員的評(píng)價(jià)單獨(dú)進(jìn)行，評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)分為 10 個(gè)等級(jí)：0 分（極弱）～100 分（極強(qiáng)）。

表1 白桑椹檸檬果酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of white mulberry-lemon wine

1.3.5 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果上，以感官評(píng)分作為基礎(chǔ)，各理化檢測(cè)作為標(biāo)準(zhǔn)，綜合考慮對(duì)發(fā)酵品質(zhì)影響的主因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定白桑椹檸檬果酒優(yōu)化工藝組合。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

酒精度、總酸、揮發(fā)酸及總糖含量均為平行測(cè)定數(shù)據(jù) 3 次，Excel 2007 和 SPSS20.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；采用Origin 9.0 進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)檢測(cè)，桑椹果汁呈亮紅色，色澤鮮亮，糖度14%，可溶性固形物（soluble solids content，SSC）11.5%，總酸（以檸檬酸計(jì)）3.81g/kg，pH 值3.72，菌落總數(shù) 65 CFU/mL，大腸菌群未檢出；檸檬果汁呈乳黃色，均勻混濁狀，可溶性固形物（SSC）37.5%，總酸（以檸檬酸計(jì)）18.81 g/kg，菌落總數(shù)385 CFU/mL，大腸菌群12 MPN/100 mL，霉菌及酵母7 CFU/mL，致病菌未檢出。

2.1 白桑椹檸檬果酒工藝優(yōu)化單因子試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 白桑椹與檸檬汁復(fù)合比對(duì)果酒品質(zhì)影響

調(diào)整發(fā)酵液糖度為24%，pH 3.6，接種量1%，白桑椹與檸檬汁體積比分別為 100∶2、100∶4、100∶6、100∶8、100∶10，25 ℃恒溫發(fā)酵 7 d，定期取樣測(cè)發(fā)酵液中總糖、酒精度、揮發(fā)酸及總酸含量，考察白桑椹與檸檬汁復(fù)合比對(duì)果酒發(fā)酵影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1 知，桑椹汁與檸檬汁比例為100∶4（體積比）時(shí)，釀酒酵母發(fā)酵速度快，酒精度最高，達(dá)13.8%vol，殘?zhí)橇孔畹?，?.8%，形成酒香濃郁、口感豐滿、典型性強(qiáng)的白桑椹檸檬果酒?？紤]到果汁比對(duì)發(fā)酵影響不明顯，故在正交試驗(yàn)中果汁復(fù)合比將不作為主因素，在后續(xù)研究中白桑椹與檸檬汁體積比均設(shè)定為100∶4。

圖1 白桑椹與檸檬汁復(fù)合比對(duì)白桑椹檸檬果酒品質(zhì)的影響Fig.1 The effect of the ratio of white mulberry and lemon juice on the quality of mulberry wine

2.1.2 SO2添加量對(duì)復(fù)合果酒品質(zhì)的影響

調(diào)節(jié)糖度為24%，pH 3.6，接種量1%，加入偏重亞硫酸鉀使果汁中 SO2終濃度分別為 15、30、45、60、75 mg/L，25 ℃發(fā)酵，主發(fā)酵結(jié)束后取樣測(cè)發(fā)酵液中總糖、酒精度、揮發(fā)酸及總酸含量，檢驗(yàn)SO2濃度對(duì)果酒發(fā)酵效果的影響，結(jié)果如圖2。

由圖2 知，隨SO2量增加，雜菌去除越徹底，果酒品質(zhì)提高；當(dāng)添加超45 mg/L 時(shí)，反而抑制酵母生長(zhǎng)，產(chǎn)生澀苦味，不利香氣形成。考慮到SO2濃度對(duì)整個(gè)發(fā)酵影響不明顯，在正交試驗(yàn)中不作為考察因子進(jìn)行考慮，后續(xù)試驗(yàn)中SO2濃度均設(shè)定為45 mg/L。

圖2 SO2 添加量對(duì)白桑椹檸檬果酒品質(zhì)的影響Fig.2 The effect of SO2 addition on the quality of compound white mulberry wine

2.1.3 酵母接種量對(duì)復(fù)合果酒品質(zhì)的影響

調(diào)整糖度為24%，pH3.6，分別接入0.2%、0.6%、1.0%、1.4%、1.8%、2.2%活化酵母，25 ℃恒溫發(fā)酵 7 d，取樣測(cè)酒精度、總酸、揮發(fā)酸及發(fā)酵液中殘余糖含量，考察酵母接種量對(duì)果酒發(fā)酵影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 結(jié)果表明，當(dāng)接種量過(guò)小時(shí)，酵母菌生長(zhǎng)緩慢，繁殖速率下降，對(duì)糖的利用水平亦隨之下降，使得發(fā)酵液中總糖含量過(guò)高。當(dāng)接種量在0.2%～1.0%區(qū)間時(shí)，發(fā)酵液中殘余總糖的量隨接種量增加而下降，將接種量增至1.4 %時(shí)發(fā)酵液中殘余總糖的量反而上升。若繼續(xù)增加接種量，殘余總糖的量又下降，但酒精含量亦降低，可能是因酵母旺盛的生長(zhǎng)繁殖消耗了大部分糖，而導(dǎo)致酒精產(chǎn)量降低?？紤]到接種量對(duì)發(fā)酵影響不大，故正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)中將不作為考察因素進(jìn)行考慮，在后續(xù)試驗(yàn)中將酵母接種量固定為1.0%。

圖3 初始酵母接種量對(duì)白桑椹檸檬果酒品質(zhì)的影響Fig.3 The effect of initial yeast inoculation quantity on quality of compound white mulberry wine

2.1.4 起始糖度對(duì)果酒品質(zhì)影響

將復(fù)合果汁起始糖度分別調(diào)至16%、18%、20%、22%、24%、26%，起始 pH 值為 3.6，接種量 1%，25 ℃恒溫發(fā)酵7 d，定期取樣測(cè)發(fā)酵液中總糖、酒精度、揮發(fā)酸及總酸含量，測(cè)試起始糖度對(duì)發(fā)酵效果的影響，結(jié)果如圖4。

由圖4 可看出，當(dāng)起始糖度為24%時(shí)，發(fā)酵液最終酒精度最高，達(dá)到13.9%，但殘余總糖量亦達(dá)8.9%。糖是酵母生長(zhǎng)時(shí)的碳源和能量來(lái)源，厭氧時(shí)酵母能將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇，但當(dāng)起始糖度過(guò)高時(shí)則會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液產(chǎn)生較高滲透壓而不利于酵母生長(zhǎng)繁殖，使發(fā)酵不徹底[12]。由圖4 殘余糖量變化知，發(fā)酵液起始糖濃度越高，發(fā)酵后殘余糖量亦愈高，說(shuō)明糖酒轉(zhuǎn)化效率低。當(dāng)起始糖度達(dá)到26 %，發(fā)酵液最終的殘余糖量達(dá)10.2%。綜合考慮各方因素，將發(fā)酵液起始糖度確定為24%較為適宜。

2.1.5 起始pH 值對(duì)果酒品質(zhì)影響

調(diào)整發(fā)酵液起始 pH 值分別為 2.7、3.0、3.3、3.6、3.9、4.2，起始糖度 24%，25 ℃恒溫發(fā)酵 7 d，定期取樣測(cè)發(fā)酵液中總糖、酒精度、揮發(fā)酸及總酸含量，考察起始pH 值對(duì)桑椹果酒發(fā)酵的影響，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5 知，起始pH 值為3.6 時(shí)，酒精度達(dá)最大值13.5%，對(duì)應(yīng)殘?zhí)橇孔畹停瑸?.2%。而當(dāng)起始pH 值為3.9 時(shí)，酒精度達(dá)13%，殘?zhí)橇?.5%。說(shuō)明pH 值為3.6～3.9 環(huán)境中酵母生長(zhǎng)旺盛，對(duì)糖利用較為徹底。當(dāng)pH 值達(dá)4.2 時(shí)，發(fā)酵液酒精含量下降明顯，殘?zhí)橇可?，這可能是因?yàn)樵谠損H 值條件下，易感雜菌而不利于酵母生長(zhǎng)，正交優(yōu)化時(shí)，起始pH 值確定為3.3、3.6和3.9。

圖4 起始糖度對(duì)白桑椹檸檬果酒品質(zhì)的影響Fig.4 Effects of initial sugar content on the quality of mulberry wine

圖5 起始pH 值對(duì)白桑椹檸檬果酒品質(zhì)的影響Fig.5 Effects of initial pH value on the quality of mulberry wine

圖6 發(fā)酵溫度對(duì)白桑椹檸檬果酒品質(zhì)影響Fig.6 Effects of fermentation temperature on the quality of wine

2.1.6 發(fā)酵溫度對(duì)果酒品質(zhì)影響

調(diào)整發(fā)酵液起始糖度24%，起始pH 值3.6，于15、20、25、30 ℃恒溫發(fā)酵 7 d，定期取樣測(cè)發(fā)酵液中總糖、酒精度、揮發(fā)酸及總酸含量，考察發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。

從圖6 可發(fā)現(xiàn)隨發(fā)酵溫度升高，發(fā)酵液中糖的消耗速率亦增加，發(fā)酵時(shí)間相應(yīng)地縮短。當(dāng)溫度升至25 ℃時(shí)，酒精度最高，達(dá)到13.7%，但發(fā)酵液中殘存的總糖量亦較高，為8.2%，進(jìn)一步提高發(fā)酵溫度，果酒的酒精度含量下降明顯，其原因可能為溫度高，酵母繁殖快，代謝旺盛，但高溫亦會(huì)使酵母較早衰亡，從而縮短發(fā)酵的周期[14-15]，導(dǎo)致糖的利用效率下降；溫度低會(huì)抑制酵母生長(zhǎng)繁殖，使得發(fā)酵啟動(dòng)緩慢，不利于糖的轉(zhuǎn)化，且易滋生雜菌。綜合考慮，將主發(fā)酵階段溫度定為25 ℃較為適宜。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

為優(yōu)化白桑椹檸檬果酒釀制工藝，在單因素試驗(yàn)結(jié)果上，在確定白桑椹檸檬果汁體積比為100∶4、接種量0.035%（以干酵母量計(jì)）、SO2添加量45 mg/L 條件下，以起始糖度（A）、起始 pH 值（B）和主發(fā)酵溫度（C）為影響主因子，以感官評(píng)分（Y）為指標(biāo)值進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，探討主因子因素和水平對(duì)果酒品質(zhì)影響，確立果酒釀造優(yōu)化工藝，并在優(yōu)化工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平如表2。

表2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平設(shè)置表Table 2 Factors and levels of orthogonal design experiments

2.2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 白桑椹檸檬果酒發(fā)酵正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiment for mulberry compound wine fermentation optimization

由表3 知，對(duì)白桑椹檸檬果酒品質(zhì)影響由大到小順序依次為：起始pH 值＞主發(fā)酵溫度＞起始糖度。優(yōu)化條件為A2B2C3。即起始糖度24%，起始pH 值3.6，主發(fā)酵溫度25 ℃。

2.2.2 正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)方差分析

正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果的方差分析結(jié)果如表4。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表4可知，pH 值對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），主發(fā)酵溫度及起始糖度對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性，對(duì)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)分析得出的優(yōu)化條件進(jìn)行平行驗(yàn)證使驗(yàn)，所釀造出的白桑椹檸檬果酒各項(xiàng)指標(biāo)分別為酒精度14.0%vol、總酸（以酒石酸計(jì)）7.6 g/L、揮發(fā)酸（以乙酸計(jì)）0.56 g/L、總糖（以葡萄糖計(jì)）8.1 g/L、二氧化硫116 mg/L、干浸出物13.2 g/L，未檢測(cè)出致病微生物及有害金屬離子；果酒呈淡紅色，具有純正、優(yōu)雅、怡悅、和諧的果香與酒香，酒液清亮，酸甜適口，醇厚純凈無(wú)異味，酒體完整，具有果酒應(yīng)有的特征及風(fēng)味；果酒綜合感官評(píng)價(jià)值為89.7，大于正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)表中的最高感官評(píng)價(jià)值88.6?？烧J(rèn)為本正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果有效、可信，表明該最佳工藝條件是合理，可靠的。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)白桑椹檸檬酒發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，其優(yōu)化的釀造工藝參數(shù)為：初始干酵母接種量0.035%、添加偏重亞硫酸鉀使起始發(fā)酵液中SO2濃度為45 mg/L、白桑椹與檸檬果汁體積比為100∶4、起始pH 值3.6、起始糖度24%和主發(fā)酵溫度25 ℃，在此發(fā)酵條件下得到白桑椹檸檬果酒酒體豐滿，協(xié)調(diào)性好，酒香濃郁，典型性好。