柏秋月，鄧百萬(wàn)，，楊學(xué)英，解修超，劉軍生，羅陽(yáng)蘭

（1.陜西理工大學(xué)陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西 漢中 723001；2.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001）

羊肚菌（Morchella esculenta），俗稱羊肚菜、羊肚蘑，隸屬于子囊菌門（Ascomycota）盤菌目（Pezizales）羊肚菌屬（Morchella），是一種珍貴的食藥用菌[1]。研究表明，羊肚菌營(yíng)養(yǎng)豐富，含有多種維生素、蛋白質(zhì)和多種氨基酸[2]。羊肚菌還含有多種活性成分，如多糖、脂肪酸化合物[3]、礦物質(zhì)[4]等，活性十分廣泛。其多糖成分具有抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、抑菌等功效[5]。因此，羊肚菌在保健及醫(yī)學(xué)界中備受關(guān)注。且有文獻(xiàn)報(bào)道，真菌多糖具有良好的抗氧化作用，能夠有效緩解氧化壓力[6]。

但目前大多數(shù)抗氧化劑為人工合成，對(duì)人類健康有一定的危害，因此，尋求無(wú)毒無(wú)害的天然抗氧化劑成為了國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[7]?，F(xiàn)在對(duì)羊肚菌的研究主要集中在羊肚菌分類以及人工栽培等問(wèn)題上，而有關(guān)陜南地區(qū)羊肚菌多糖成分生理活性的研究較少。

為此，本研究挑選了4 株于陜南地區(qū)生長(zhǎng)較優(yōu)的羊肚菌菌株為研究對(duì)象，通過(guò)液體培養(yǎng)并采用Sevag法[8]去除蛋白提取羊肚菌胞外多糖，檢測(cè)不同羊肚菌菌株胞外多糖水平是否有差異，并對(duì)其體外抑菌、抗氧化活性以及其對(duì)α-淀粉酶的抑制作用進(jìn)行對(duì)比，旨在為羊肚菌藥食資源開(kāi)發(fā)和利用提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試的4 株羊肚菌（Morchella esculenta，編號(hào)為YS-Y、XH-0、XH-2、XH-4） 菌種、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，菌株保藏號(hào) CMCC63501）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus，菌株保藏號(hào) ATCC25925）、大腸埃希菌（Escherichia coli，菌株保藏號(hào)ATCC25922）、白色念珠菌（Candida albicans，菌株保藏號(hào)CM CC85021）：陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心提供；維生素C（分析純，批號(hào)：20160105）：天津市天新精細(xì)化工開(kāi)發(fā)中心；伏格列波糖片（批號(hào)172180801）：石家莊市華新藥業(yè)有限責(zé)任公司；DPPH、ABTS：Sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

EYELAN100O 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海愛(ài)郎儀器有限公司；SW-CJ-1D 型單人超凈工作臺(tái)：上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司；YXQ-LS-50S 型高壓滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；KQ5200DE 超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；UA2550 型紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；DYCZ-22A 型水平電泳儀：北京六一廠。

1.3 方法

1.3.1 羊肚菌菌種的培養(yǎng)

將供試的4 株羊肚菌在超凈工作臺(tái)中各取0.5 cm2接種于馬鈴薯瓊脂（potato dextrose agar，PDA）固體培養(yǎng)基和察式培養(yǎng)基上，25 ℃，培養(yǎng)3 d～4 d。

1.3.2 羊肚菌菌種形態(tài)鑒定及內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）分子鑒定

將察氏培養(yǎng)基上的菌絲采用棉藍(lán)染色法在光學(xué)顯微鏡下對(duì)菌絲體的形態(tài)和大小進(jìn)行鑒定[9]。

將PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)的羊肚菌菌絲體利用十六烷基三甲基溴化銨法（cetyltrimethylammonium ammonium bromide，CTAB）提取DNA，并采用真菌通用引物ITS-1 （5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′） 和 ITS-4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行擴(kuò)增。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)體系（50 μL）：2×Taq Master Mix 25 μL，10 μmoL/L 上、下游引物各 2 μL，模板 DNA 1 μL，ddH2O 補(bǔ)至 50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 1 min，58 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min，36 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。4 ℃保存，備用；PCR 產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，將測(cè)得序列提交NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast 同源比對(duì)，使用MEGA7.0 軟件分析，使用Neighbor-Joining法構(gòu)建菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，確定菌株的分類地位。

1.3.3 羊肚菌多糖的提取

取供試的4 株羊肚菌在超凈工作臺(tái)中各取0.5 cm2接種于含PDA 液體培養(yǎng)基150 mL 的250 mL 三角瓶中，25 ℃，160 r/min 液體培養(yǎng) 6 d～7d 直至瓶中長(zhǎng)滿菌絲球，進(jìn)行抽濾，收集其濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40 ℃濃縮至60 mL，并采用Sevag 法脫蛋白，取濾液與Sevag 試劑按 3∶1（體積比）置于 250 mL 三角瓶中，120 r/min 振蕩30 min，轉(zhuǎn)入分液漏斗中靜置30 min，重復(fù)3 次，取上層清液。真空濃縮至50 mL 后轉(zhuǎn)入三角瓶中，并加入3 倍體積的無(wú)水乙醇，4 ℃靜置過(guò)夜。3 500 r/min 離心10 min，45 ℃干燥至恒重，即得到羊肚菌胞外多糖。

1.3.4 羊肚菌多糖含量的測(cè)定

稱取0.100 0 g 預(yù)先干燥至恒質(zhì)量的分析純葡萄糖，去離子水定容至100 mL，得到1 mg/mL 的溶液，取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，去離子水補(bǔ)至 10 mL，得到 10、20、40、60、80、100 μg/mL 的溶液，以去離子水為空白試劑；再取0.100 0 g 不同的羊肚菌胞外多糖，去離子水定容至10 mL，得到10 mg/mL 的溶液。

采用苯酚-濃硫酸法[10]測(cè)定總糖含量：分別取不同濃度的葡萄糖標(biāo)品和不同羊肚菌胞外多糖溶液1 mL于試管中，加入5%的苯酚溶液1 mL，濃硫酸5 mL，混勻后沸水浴15 min，立即放入冷水中冷卻5 min，定容至10 mL，于490 nm 處測(cè)定吸光度，得到葡萄糖中總糖的線形回歸方程：y=0.041 3x+0.039 3，R2=0.997 4；采用 3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測(cè)定還原糖含量：分別取不同濃度的葡萄糖標(biāo)品和不同羊肚菌胞外多糖溶液1 mL 于試管中，加入4 mL DNS，1 mL 去離子水。沸水浴5 min，立即置于冷水中，冷卻至25 ℃，定容至10 mL，搖勻，于540 nm 測(cè)定其吸光度，得到葡萄糖中還原糖的線形回歸方程：y=0.210 9x-0.019 8，R2=0.998 7。以上兩者之差即為羊肚菌胞外多糖的含量，計(jì)算公式為：

羊肚菌胞外多糖含量=總糖含量-還原糖含量

1.4 羊肚菌抑菌活性研究

采用濾紙片擴(kuò)散法[11]研究羊肚菌多糖成分對(duì)致病菌的抑菌效果，將活化的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大腸埃希菌（Escherichia coli）、白色念珠菌（Candida albicans）稀釋于無(wú)菌水中制備成菌懸液，均勻地涂布在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，以浸泡過(guò)無(wú)菌水的濾紙片為陰性對(duì)照組，以浸泡青霉素溶液（10 mg/mL）的濾紙片為陽(yáng)性對(duì)照組，以羊肚菌胞外多糖溶液（10 mg/mL）的濾紙（直徑為5 mm）為樣品組，輕放在培養(yǎng)基表面，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，24 h 后以十字交叉法測(cè)定抑菌直徑D，抑菌效果（E）按下列公式計(jì)算：

E=（D樣品組-D陰性對(duì)照組）/（D陽(yáng)性對(duì)照組-D陰性對(duì)照組）

1.5 抗氧化活性的測(cè)定

1.5.1 還原能力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[12]，稍加改動(dòng)，將不同的羊肚菌樣品配制成 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 不同濃度的樣品溶液，取1 mL 樣品，加入1 mL pH6.6 的磷酸緩沖液、1 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，混勻后置于50 ℃水浴，反應(yīng)20 min，然后加入1 mL 10 %的三氯乙酸，混勻后靜置10 min，取上清液2 mL，加入2 mL 去離子水和200 μL 0.1%三氯化鐵溶液，靜置 10 min 后測(cè)定OD700，以VC為陽(yáng)性對(duì)照，每樣重復(fù)3 次，取平均值。

1.5.2 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[13]，稍加改動(dòng)，將不同的羊肚菌樣品配制成 1、2、4、6、8、10 mg/mL 不同濃度的樣品溶液，取2 mL 的樣品溶液加入1 mL 0.2 mmol/LDPPH-乙醇溶液，混勻，放置 25 ℃暗處 10 min 后測(cè)定 OD517，以 VC為陽(yáng)性對(duì)照，每樣重復(fù)3 次，取平均值，并按以下公式計(jì)算DPPH 自由基清除率：

清除率/%=[1-（AS-ASB）/（AC-ACB）]×100

式中：AS為2 mL 樣品液+1 mL DPPH-乙醇溶液的樣品吸光值；ASB為2 mL 樣品液+1 mL 99.9 %乙醇溶液的樣品對(duì)照組吸光值；AC為2 mL 去離子水+1 mL DPPH-99.9%乙醇溶液的空白組吸光值；ACB為2 mL 去離子水+1 mL 99.9%乙醇溶液的空白對(duì)照組吸光值。

1.5.3 ABTS+自由基清除能力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[14]，稍加改動(dòng)，將 7 mmol/L 的 ABTS 溶液和2.45 mmol/L 的過(guò)硫酸鉀溶液等體積混合，避光條件下，25 ℃靜置過(guò)夜，形成ABTS 儲(chǔ)備液。使用前將ABTS 儲(chǔ)備液用無(wú)水乙醇稀釋（約稀釋50 倍），即OD734為0.7±0.02。將不同的羊肚菌樣品配制成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 不同濃度的樣品溶液，取 1 mL 樣品溶入2 mL ABTS 工作液，振蕩混勻，置于暗處5 min 后測(cè)定OD734，每樣重復(fù)3 次，取平均值，并按以下公式計(jì)算ABTS+自由基清除率：

清除率/%=[1-（AS-ASB）/（AC-ACB）]×100

式中：AS為 1 mL 樣品液+2 mL ABTS 工作液的樣品吸光值；ASB為1 mL 樣品+2 mL 99.9%乙醇溶液的樣品對(duì)照組吸收值；AC為1 mL 去離子水+2 mL ABTS工作液的空白組吸光值；ACB為1 mL 去離子水+2 mL 99.9%乙醇溶液的空白對(duì)照組吸光值。

1.5.4 羥自由基清除作用

參照文獻(xiàn)[15]，稍加改動(dòng)，將不同的羊肚菌樣品配制成 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 不同濃度的樣品溶液，取1 mL 樣品分別加入9 mmol/L FeSO4和9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液各2 mL，最后加入1.2 mmol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，于37 ℃反應(yīng)30 min，以去離子水調(diào)零在波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)定樣品吸光度A1；另以去離子水代替H2O2溶液重復(fù)以上操作，測(cè)定羊肚菌本身的吸光度值A(chǔ)2，同時(shí)以去離子水代替羊肚菌樣品測(cè)定吸光度A0，以0.1 mg/L 為陽(yáng)性對(duì)照，每樣重復(fù)3 次，取平均值，并按以下公式計(jì)算羥自由基清除率：

清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

1.5.5 α 淀粉酶抑制作用的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[16]，稍加改動(dòng)，分別取不同羊肚菌樣品0.5 mL，加入0.5 mL 1 unit/mL 的α 淀粉酶溶液與0.5 mL 0.25%的淀粉溶液，混勻于37 ℃恒溫反應(yīng)10 min，然后加入1 mLDNS 溶液，37 ℃恒溫反應(yīng)5 min 后，在沸水浴中加熱15 min，冷卻后用磷酸緩沖液定容至10 mL，測(cè)定OD575；以磷酸緩沖液代替α 淀粉酶作空白對(duì)照。以伏格列波糖片為陽(yáng)性對(duì)照，每樣重復(fù)3 次，取平均值，并按以下公式計(jì)算α 淀粉酶活性的抑制率：

清除率/%=[1-（AS-ASB）/（AC-ACB）]×100

式中：AS為 0.5 mL 樣品液+0.5 mL α-淀粉酶溶液的樣品組吸光值；ASB為0.5 mL 樣品液+0.5 mL 磷酸緩沖液（替代α-淀粉酶溶液）的樣品對(duì)照組吸光值；AC為0.5 mL 去離子水+0.5 mL α-淀粉酶溶液的空白組吸光值；ACB為0.5 mL 去離子水+0.5 mL 磷酸緩沖液（替代α-淀粉酶溶液）的空白對(duì)照組吸光值。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

使用MEGA7.0 軟件分析，使用Neighbor-Joining法構(gòu)建菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

采用Excel 2010 軟件進(jìn)行線性擬合，得到相關(guān)方程，計(jì)算相應(yīng)的數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株菌落形態(tài)及顯微特征

羊肚菌菌落形態(tài)與顯微特征圖見(jiàn)圖1。

羊肚菌菌落形態(tài)及顯微特征：菌落邊緣整齊，菌絲緊貼培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)，氣生菌絲較少。在顯微鏡下觀察，菌絲呈竹節(jié)狀且具有分枝，有隔，分隔處縊縮，隔膜明顯加厚[17]。

圖1 羊肚菌菌落形態(tài)與顯微特征圖Fig.1 Morphology and microscopic characteristics of Morchella colonies

2.2 菌株序列分析

羊肚菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖2。

菌株 YS-Y 、XH-0、XH-2、XH-4 ITS 的擴(kuò)增結(jié)果顯示其序列大小在800 bp 左右。

將以上4 株菌種ITS 序列測(cè)序后，提交至Gen－Bank 數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行序列分析和相似性比較，并建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。由圖2 可知，菌株XH-0、XH-2、XH-4、YS-Y 與羊肚菌相似率達(dá)97%，說(shuō)明4 株菌株屬于羊肚菌。

2.3 4株羊肚菌胞外多糖含量

根據(jù)1.3.4 的方法及計(jì)算公式，得出菌株胞外多糖含量如表1。

菌株 YS-Y 、XH-0、XH-2、XH-4 胞外多糖的含量分別為10.05%、5.80%、19.89%、8.34%。將數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析結(jié)果表明P<0.01，各菌株胞外多糖含量差異極顯著。

圖2 羊肚菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Morchella phylogenetic tree

2.4 羊肚菌胞外多糖抑菌活性分析

陰性對(duì)照組紙片周圍無(wú)抑菌圈出現(xiàn)，表明水對(duì)細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)無(wú)抑制作用。陽(yáng)性對(duì)照組10 mg/mL 青霉素溶液周圍出現(xiàn)抑菌圈，且＞1 cm，表明試驗(yàn)方法無(wú)誤且可行。4 種羊肚菌胞外多糖成分對(duì)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大腸埃希菌（Escherichia coli）、白色念珠菌（Candida albicans）抑菌程度不同，抑菌效果見(jiàn)表2。

表2 羊肚菌胞外多糖成分抗菌分析Table 2 Antibacterial analysis of extracellular polysaccharide components from Morchella sp.

上述研究表明，4 株羊肚菌對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制效果較好，對(duì)白色念球菌和枯草芽孢桿菌的抑制效果較差，菌株XH-2 對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制效果最好，但對(duì)枯草芽孢桿菌無(wú)抑制作用，其余3 株對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果較低。

2.5 4株羊肚菌抗氧化能力的評(píng)價(jià)

2.5.1 還原能力測(cè)定

羊肚菌胞外多糖的還原能力見(jiàn)圖3。

圖3 羊肚菌胞外多糖的還原能力Fig.3 Reduction ability of extracellular polysaccharides from Morchella esculenta

由圖3 可知，4 株羊肚菌胞外多糖表現(xiàn)出不同程度的還原能力，且隨質(zhì)量濃度的升高而逐漸增加，4 株羊肚菌以及 VC的還原力大小 VC＞XH-2＞XH-0＞XH-4＞YS-Y。當(dāng)質(zhì)量濃度由0.1 mg/mL 升至0.6 mg/mL 時(shí)，菌株XH-0 的還原能力變化最快；當(dāng)質(zhì)量濃度由0.8 mg/mL 升至1.0mg/mL 時(shí)，菌株XH-2 的還原能力變化最快，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 mg/mL 時(shí)，菌株YS-Y、XH-0、XH-2、XH-4 以及 VC的 OD700吸光值分別為0.10±0.02、0.13±0.03、0.13±0.06、0.12±0.06 和 0.16±0.08。結(jié)果表明，菌株XH-2 胞外多糖的還原能力優(yōu)于其他3 株，其次是菌株XH-0，但4 株羊肚菌的還原能力都不及VC。

2.5.2 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定

羊肚菌胞外多糖的DPPH 自由基清除率見(jiàn)圖4。

由圖4 可知，4 株羊肚菌胞外多糖都具有一定的DPPH 自由基清除能力，隨著質(zhì)量濃度的增加，其DPPH 自由基的清除能力也在不斷地增加，且呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，4 株羊肚菌以及VC的DPPH 自由基的清除能力大小為 VC＞XH-4＞XH-2＞YH-Y＞XH-0，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 mg/mL 時(shí)，其清除率分別為72.30%、39.37%、39.24%、38.58%、34.32%；通過(guò)其關(guān)系進(jìn)行線性回歸方程的擬合進(jìn)而計(jì)算出YS-Y、XH-0、XH-2、XH-4 以及 VC的 EC50分別為 23.32、25.23、17.86、16.68、1.74 mg/mL。結(jié)果表明，菌株 XH-4 胞外多糖的DPPH 自由基清除率高于其它3 株，其EC50為16.68 mg/mL，這比鮑敏等[18]研究的羊肚菌胞外多糖對(duì)DPPH 自由基的清除率低，可能是由于提取工藝未優(yōu)化，多糖活性受損導(dǎo)致的。

2.5.3 ABTS+自由基清除能力測(cè)定

羊肚菌胞外多糖的ABTS+自由基清除率見(jiàn)圖5。

圖4 羊肚菌胞外多糖的DPPH 自由基清除率Fig.4 DPPH free radical scavenging rate of extracellular polysaccharides from Morchella esculenta

圖5 羊肚菌胞外多糖的ABTS+自由基清除率Fig.5 ABTS+free radical scavenging rate of extracellular polysaccharides from Morchella esculenta

由圖5 可知，4 株羊肚菌胞外多糖有著較強(qiáng)的ABTS+自由基清除能力，一般認(rèn)為某種質(zhì)的EC50低于10 mg/mL，表明其具有較好的抗氧化性[19]。其多糖成分對(duì)ABTS+自由基清除率隨著其質(zhì)量濃度的增加，清除能力也不斷增加。4 株羊肚菌以及VC的ABTS+自由基清除能力大小為 VC＞XH-2＞XH-4＞XH-0＞YS-Y，當(dāng)濃度達(dá)到1.0 mg/mL 時(shí)，其ABTS+自由基清除率分別為97.47%、75.25%、56.82%、43.18%、33.33%；4 種羊肚菌胞外多糖成分以VC的ABTS+自由基清除率通過(guò)線性擬合計(jì)算得出其 EC50分別為 0.49、0.56、0.87、0.97、1.91 mg/mL。結(jié)果表明，4 株羊肚菌都具有較強(qiáng)的ABTS+自由基清除率，菌株XH-2 的ABTS+自由基清除率高于其它3 株。

2.5.4 羥自由基清除能力的測(cè)定

羥基是一種對(duì)機(jī)體危害最大的活性氧自由基，它可以損害機(jī)體內(nèi)所有的生物大分子，羥自由基不能被特異的酶促反應(yīng)降解，因此，維持細(xì)胞和機(jī)體正常的功能必須清除羥自由基[20]。羊肚菌胞外多糖的羥自由基清除率見(jiàn)圖6。

圖6 羊肚菌胞外多糖的羥自由基清除率Fig.6 Scavenging rate of hydroxyl radicals of extracellular polysaccharides from Morchella esculenta

由圖6 可知，4 株羊肚菌胞外多糖有一定程度的羥自由基清除能力，隨著質(zhì)量濃度的增加其清除能力也不斷增強(qiáng)。4 株羊肚菌以及VC的羥自由基清除能力大小為 XH-4＞XH-0＞YS-Y＞XH-2 ＞VC。當(dāng)濃度達(dá)到1.0 mg/mL 時(shí)，其羥自由基清除率分別為35.78 %、30.50%、30.34%、29.83%、23.94%，對(duì)羥自由基的清除率進(jìn)行線性擬合并計(jì)算出其EC50分別為1.40、1.75、1.76、2.09、3.09 mg/mL。結(jié)果表明，4 株羊肚菌的羥自由基清除率高于VC，且菌株XH-4 的羥自由基清除率達(dá)到了75.25%，這與任嘉興等[21]研究結(jié)果相近，說(shuō)明菌株XH-4 具有較強(qiáng)的羥自由基清除能力。

2.5.5 對(duì)α 淀粉酶抑制效果的測(cè)定

羊肚菌胞外多糖對(duì)α 淀粉酶的抑制率見(jiàn)圖7。

由圖7 可知，羊肚菌胞外多糖成分對(duì)α-淀粉酶有較強(qiáng)的抑制作用，并且隨著其濃度的增加，對(duì)α-淀粉酶的抑制作用也不斷增強(qiáng)。4 種羊肚菌胞外多糖以及伏格列波糖片對(duì)α-淀粉酶的抑制率從大到小排序?yàn)榉窳胁ㄌ瞧綳H-2＞YS-Y＞XH-4＞XH-0，當(dāng)濃度達(dá)到1.0 mg/mL 時(shí)，其抑制率分別為47.38%、35.04%、32.91%、32.20%、25.97%，對(duì)4 種羊肚菌胞外多糖以及伏格列波糖片對(duì)α-淀粉酶的抑制率進(jìn)行線性回歸方程擬合，計(jì)算其各自的EC50分別為1.15、1.55、2.04、2.27、2.38 mg/mL，說(shuō)明4 株羊肚菌對(duì)α-淀粉酶的抑制作用較強(qiáng)，菌株XH-2 對(duì)α-淀粉酶的抑制率優(yōu)于其他3 株，但都低于伏格列波糖片。

圖7 羊肚菌胞外多糖對(duì)α 淀粉酶的抑制率Fig.7 Inhibitory rate of extracellular polysaccharide from Morchella esculenta on alpha amylase

3 結(jié)論

4 株羊肚菌菌株對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有較好的抑制效果，菌株XH-2 對(duì)這兩種致病菌的抑制效果最好，這可能與羊肚菌的抗菌和抗病毒的活性成分有關(guān)。

采用Sevag 法提取的羊肚菌胞外多糖具有一定程度的抗氧化能力和對(duì)α-淀粉酶的抑制能力。4 株羊肚菌對(duì)羥自由基清除能力都高于VC，且當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 mg/mL，菌株XH-4 羥自由基清除率達(dá)到了75.25%；菌株XH-2 的還原力為0.13±0.06，優(yōu)于其他3 株，且與VC差異不顯著。且其菌株對(duì)ABTS+自由基的清除能力和對(duì)α-淀粉酶的抑制能力均優(yōu)于其他3 株，其EC50分別為 0.56 mg/mL 和 1.55 mg/mL，其 EC50均低于10 mg/mL，表明其具有較好的還原力和清除能力。菌株XH-4 對(duì)DPPH 自由基清除能力高于其它3 株，其EC50為16.68 mg/mL。由此可知，菌株XH-2 和菌株XH-4 的抗氧化性以及對(duì)α-淀粉酶的抑制能力效果較好，可為開(kāi)發(fā)羊肚菌的天然高效氧化劑提供一定的依據(jù)。

結(jié)果表明羊肚菌胞外多糖有一定的抗氧化作用以及抑菌效果，但本研究只對(duì)體外進(jìn)行了抗氧化和抑菌能力測(cè)定，未在體內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，因此需要進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)對(duì)羊肚菌胞外多糖在體內(nèi)的生物活性進(jìn)行驗(yàn)證，并且未測(cè)定4 株羊肚菌菌株對(duì)致病菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，需要后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步測(cè)定，以期為羊肚菌藥用資源開(kāi)發(fā)提供一定的依據(jù)。