曹玉珍，張乾昆，孫敬來，張力新，余?輝，龐天翔

BM-MSCs的CNN特征映射與活性評價模型研究

曹玉珍1，張乾昆1，孫敬來1，張力新1，余?輝1，龐天翔2

(1.天津大學生物醫(yī)學檢測技術與儀器天津市重點實驗室，天津 300072；2.中國醫(yī)學科學院北京協和醫(yī)學院血液病與血液病研究所國家重點實驗室，天津 300020)

針對分選富集具有治療疾病效果的干細胞(MSCs)亞群很難實現質量控制的問題，設計了以深度神經網絡作為特征映射的主成分分析-嶺回歸模型，實現對骨髓間充質干細胞(BM-MSCs)的定量評價．通過三維重建細胞計算基于長軸的最大截面作為模型輸入；訓練4層神經網絡將細胞分為正常細胞與病人細胞，提取全連接層輸出作為特征映射；利用主成分分析降維后的前3項主成分向量作為自變量，樣本評分作為因變量，使用嶺回歸模型進行擬合，將特征與細胞活性評分相聯系，實現BM-MSCs活性定量評價，為后續(xù)分選高質量的活性細胞提供依據．第1階段通過對176例細胞樣本進行數據擴增，采用8折交叉驗證輸入二分類神經網絡進行訓練，第2階段將其中標有專家評分的68例細胞樣本輸入到已訓練的神經網絡中提取全連接層輸出作為特征，利用主成分分析-嶺回歸模型實現定量評價，結果表明：神經網絡二分類準確率98.75%，敏感度為97.84%，特異度為99.43%，對于定量評價，模型總體樣本的2為0.8736，擬合效果良好，可以實現對BM-MSCs定量評價．

干細胞；深度學習；特征映射；主成分分析；定量評價

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSC)具有支持造血干細胞和造血祖細胞增殖，調節(jié)骨髓微環(huán)境的重要作用，并具有多向分化潛能[1]．化療藥物、放射線、白血病細胞都能使BM-MSCs損傷和衰老，衰老間充質干細胞支持造血功能顯著降低，是導致白血病患者正常造血功能衰竭的重要原因[2]．BM-MSCs在多種組織中的免疫調節(jié)方面發(fā)揮重要作用，具有治療多種免疫異常所致疾病的潛能[3-4]．雖然大量研究已經使干細胞臨床應用更進一步，但可能是由于干細胞群體異質性，結果仍無定論，很難實現質量控制[5]．

流式細胞技術通過標記細胞表面分子，能夠精確分析和分選細胞亞群，為科學研究提供了重要研究方法．但是，流式細胞技術不能精確鑒別細胞活性狀態(tài)．機器學習預測干細胞外觀已經成為可能[6]，Caicedo等[7]提出基于圖像方式可以獲得細胞的特征，進而聯系細胞生物功能，文獻[8-10]在很多領域應用深度學習取得成功，Nitta等[11]用簡單的神經網絡對活細胞分類，建立了基于圖像的流式細胞儀，為圖像與細胞之間建立了聯系，但是沒有對細胞活性進行評價．

區(qū)分BM-MSCs不同活性亞群具有重要科學價值．細胞分類方式多是采用二維平面細胞圖片通過傳統方法進行處理，獲得細胞特征，無法定量評價細胞活性．通用的卷積神經網絡(convolutional neural network，CNN)模型，例如GoogLeNet和ResNet，具有龐大的架構和海量的權重系數，訓練此類網絡需要百萬級樣本數據，然而干細胞實驗代價較大，無法獲得足量樣本完成網絡訓練，因此此類現成網絡無法滿足現有需求．

本文從全新角度理解細胞結構與功能的關聯，針對小樣本數據集設計專用卷積神經網絡，使用基于長軸的最大截面作為特征平面輸入，對急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)患者/正常對照組BM-MSCs進行分類，通過遷移已訓練好的網絡并利用主成分分析-嶺回歸模型分析進行MSCs活性評價，進而鑒定功能亞群，為實現臨床急需BM-MSCs分選和富集過程的質量控制提供新思路．

1?數據獲取與預處理

1.1?細胞培養(yǎng)與數據獲取

BM-MSCs來自于28名初次診斷為AML患者和15名健康捐獻者骨髓樣本．實驗通過密度梯度離心法從新鮮骨髓樣本中分離BM-MSCs，進行體外培養(yǎng)與功能測評(微環(huán)境下細胞周期實驗與細胞衰老測評)；將培養(yǎng)的細胞用胰蛋白酶消解，計數并稀釋至每毫升1×104細胞；然后將細胞膜與細胞核分別染色，固定細胞并用共聚焦顯微鏡觀察細胞形態(tài)，并且拍攝三維細胞圖像，圖1為拍攝所得到的細胞切片圖像．實驗采用共聚焦顯微鏡(PerkinElmer)，三維成像分辨率為0.0663μm×0.0663μm×0.5μm，平面切片1000像素×1000像素．

圖1?干細胞切片

1.2?細胞三維重建

共聚焦顯微鏡獲得的圖片切片攜帶的系統噪聲，主要是由相鄰圖層熒光散焦造成的．將整個光路看做一個光學系統，則細胞與細胞圖像之間的關系為

式中：(，)表示細胞圖像；(，)代表細胞空間分布；(，)表示光學系統的傳遞函數，即點擴散函數(point spread function，PSF)；*為卷積符號．

本文采用Dainty提出的迭代盲反卷積(iterative blind deconvolution，IBD)算法對圖像進行還原[12]，然后對還原圖像進行二值化，進而采用可視化工具包(visualization toolkit，VTK)(https：//vtk.org)中的面繪制算法對細胞圖像進行三維重建．三維重建結果如圖2所示，其中純藍色代表細胞膜，棕紅色代表細?胞核．

圖2?正常和AML BM-MSCs三維結構

2?理論基礎與方法

2.1?基于長軸的細胞最大截面圖像重建算法

2.1.1?長軸計算

設細胞表面輪廓上點的坐標為(x，y，z)，＝12，，，其中為輪廓點總數，計算空間長軸時，遍歷表面輪廓上所有兩點間距離，取其中最大值就是骨髓間充質干細胞空間長軸max，其計算公式為

2.1.2?最大截面計算

其次坐標系平移，將原坐標系長軸中點點作為新坐標系原點．定義原坐標軸中任何一點在新坐標系中坐標，其計算公式為

最后，利用旋轉矩陣可以將原坐標系中所有點坐標轉換成新旋轉坐標系中坐標．經過上面3步計算，得到重切片中所需原點(點)和重切片軸中軸，圖4紅色曲線代表單位圓，圓心為點，且軸垂直于此單位圓，然后利用軸與軸(圖4藍色虛線)在單位圓上旋轉實現最大截面選?。ㄟ^BM-MSCs光學切片的重切片后，利用細胞三維結構的新坐標系，將細胞空間長軸作為旋轉軸，旋轉角步長為1°，分別獲取細胞截面，共180組截面，按照面積大小對180組截面進行排序，其中面積最大的對應原始BM-MSCs輪廓的最大截面．

圖4?旋轉后坐標系示意

Fig.4?Schematic of the coordinate system after rotation

根據最大截面坐標軸信息，對原三維細胞切片進行重切片，如圖5所示，采用VTK里的VTKImageReslice函數，可獲得該細胞的基于長軸的最大截面．

圖5?三維細胞重切片

2.2?基于CNN的細胞圖像特征映射回歸模型

2.2.1?構建卷積神經網絡

自行設計的4層神經網絡，包括兩層卷積層和兩層全連接層，結構如圖6所示，其中每個卷積層之后都采用了池化層，激活函數選擇ReLu函數，在第3層全連接層之后有dropout層及池化層，其中dropout層的設計可以防止過擬合．本設計網絡結構簡單，有效限制了權重參數的數量，非常適用于小樣本數據集學習任務．本文網絡學習分為兩階段，如圖7所示，第1階段利用卷積神經網絡進行特征映射，通過176例細胞樣本二分類標簽完成網絡參數辨識；第2階段通過遷移學習抽取特征，采用主成分分析技術進行特征降維，結合嶺回歸模型，實現對BM-MSCs的定量分析．回歸模型用68例樣本進行訓練及評價，由中國醫(yī)學科學院血液病醫(yī)院專家對細胞活性進行人工評分，分數在0～10之間，以0.5分劃分等級．

圖6?卷積神經網絡結構

2.2.2?特征映射回歸模型

將已經訓練好的網絡作為特征提取模型，提取最后全連接層8個神經元輸出作為細胞特征，然后經過主成分分析(principle component analysis，PCA)實現特征降維，經過多次驗證，前3項主成分向量特征值的貢獻率均為0.99以上，且第1項特征值貢獻率在0.9以上，以z(＝1，2，…，8)來表示第個主成分向量，選擇1、2和3作為輸入回歸模型的自變量．

圖7?二階段模型示意

采用嶺回歸建立回歸方程，此方法為防止過擬合，損失函數使用了L2正則項，即

3?數據處理結果與評價

3.1?數據擴增與交叉驗證

實驗共獲取了176例細胞樣本，其中101例健康捐獻者細胞，75例AML的細胞．由于生物實驗成本昂貴，難度較高，可重復性較小，只能獲取較小樣本數據集，而深度學習一般適用于大樣本，為了解決本問題，采用自己設計的小型網絡，通過數據擴增和交叉驗證保證設計網絡穩(wěn)定性．由于基于長軸最大截面的圖像數據為1000×1000，所以通過圖像預處理，均抽樣為32×32大小的圖片．

數據擴增是將小樣本集通過旋轉、平移、縮放、翻轉、加噪聲等方法，增加樣本數量的一種方式[13].通過數據擴增，將原本176例樣本擴增到了3694例，其中2119例健康捐獻者細胞，1575例急性髓系白血病人細胞．圖8展示了經過旋轉和翻轉等擴增后BM-MSCs圖片．

圖8?同一圖片擴增數據

采用8折交叉驗證，即將擴增后的數據平均分為8份，每份440個樣本，均含有正常細胞和AML細胞樣本，總計對上述卷積網絡訓練8次，每次使用7份數據進行訓練，剩下的1份數據作為測試集，去判斷網絡分類效果，最終得到8個訓練好的模型．

3.2?模型結果與評價

采用隨機梯度下降算法，初始學習率為0.001，損失函數選擇二分類交叉熵函數．對最大截面重采樣像素尺度進行定量測試，結果如表1所示，像素尺度過大，如128像素×128像素，會導致網絡參數過多，訓練時間較長，而準確率受限于樣本數量反而不高．綜合考慮后，本文最終選擇樣本為32像素×?32像素，經過8折交叉驗證訓練，得到平均準確率為98.75%，標準差為0.34%．高準確率和較低標準差表明模型具有較好穩(wěn)定性．

表1?深度學習模型測試結果

Tab.1?Testing results of the deep learning model

采用敏感度(sensitivity，TPR)、特異度(specific-ity，TNR)和受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線及其曲線下面積(area under curve，AUC)來評價模型應用價值．其中，敏感度值越大說明患者被診斷出患病的概率越大，漏檢率越低，模型越好，特異度值越大說明健康的人被誤診概率越小，模型越好．本模型敏感度為97.84%，特異度為99.43%，受試者特征曲線如圖9所示，其AUC為0.998，受試者曲線越靠近左上角、AUC越接近1，說明模型應用價值越高．由以上評價標準可以看出所用網絡模型適用于實驗研究．

圖9?卷積神經網絡的受試者工作特征曲線

在第2階段，采用68例細胞活性評分數據為樣本，分為兩組，其中50個樣本作為訓練集用于計算回歸模型，18個樣本作為測試集用于模型檢驗．經過特征映射回歸模型，得到

表2?回歸模型擬合結果分析

Tab.2?Fitting results analysis of the regression model

4?結?語

健康捐獻者與AML患者的BM-MSCs在顯微鏡下可以觀察到具有顯著的三維形態(tài)差異，因此可以將其形態(tài)與功能聯系起來，實現BM-MSCs的分選與識別．本文首先提出了基于長軸的最大截面的算法，在三維細胞結構中找到特征面，即使用二維特征面代替三維細胞，充分保留其結構特征；其次提出一個簡單的4層卷積神經網絡，主要針對小樣本集，使用數據擴增技術，通過訓練和測試，基于細胞形態(tài)來分析和分選細胞，實驗結果表明該模型分類效果好、穩(wěn)定性高，極具應用價值．此外本文提出通過二分類神經網絡的特征映射，進行遷移學習，采用PCA-嶺回歸模型，定量分析BM-MSCs的新思路，實驗結果表明該定量模型可以滿足臨床應用需要，進而彌補流式細胞儀在細胞功能鑒定上的不足，為細胞分析、分選和富集提供了可能．

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CNN-Based Feature Mapping and Activity State Evaluation Models of BM-MSCs

Cao Yuzhen1，Zhang Qiankun1，Sun Jinglai1，Zhang Lixin1，Yu Hui1，Pang Tianxiang2

(1. Tianjin Key Laboratory of Biomedical Testing Technology and Instruments，Tianjin University，Tianjin 300072，China；2. State Key Laboratory of Experimental Hematology，Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Tianjin 300020，China)

During sorting and enrichment of stem cell subgroups(e.g.，mesenchymal stem cells)with therapeutic effects，it is difficult to achieve quality control．A principal component analysis-ridge regression model with deep neural network as feature map is designed to achieve the quantitative evaluation of bone marrow mesenchymal stem cells(BM-MSCs)．The maximum cross sections based on the long axis are calculated as model inputs through the three-dimensional reconstruction of cells．A four-layer neural network is trained to enable the binary classification of normal and AML BM-MSCs，and the fully connected layer output is extracted as a feature map．In principal component analysis，the first three principal component vectors after dimensionality reduction are used as the independent variable，whereas the sample score is used as the dependent variable．The ridge regression model is used to fit and correlate the characteristics with the cell activity score to achieve the quantitative evaluation of BM-MSC activity，which provides a basis for the subsequent sorting of high-quality active cells．First，data are augmented from 176 cell samples as input of the neural network using an eight fold cross-validation．Then，68 cell samples labeled with expert scores are imported into the trained neural network and the fully connected layer output is extracted as a feature map．The principal component analysis-ridge regression model is used to achieve quantitative evaluation．The model results show that the accuracy of neural network classification is 98.75%，its sensitivity is 97.84%，and its specificity is 99.43%．For quantitative evaluation，the2value of the model sample is 0.8736，and the fitting effect is good．Thus，the quantitative evaluation of BM-MSCs，which can provide the basis for cell sorting and enrichment，can be achieved．

mesenchymal stem cells(MSCs)；deep learning；feature map；principal component analysis(PCA)；quantitative evaluation

TK448.21

A

0493-2137(2020)06-0626-07

10.11784/tdxbz201905105

2019-05-28；

2019-06-21.

曹玉珍（1963—??），女，博士，教授，yzcao@tju.edu.cn.

余?輝，yuhui@tju.edu.cn.

天津科技重大專項與工程資助項目(18ZXZNSY00240，16ZXCXSF00040，X-2018-31)．

Supported by Tianjin Science and Technology Major Special Project(No. 18ZXZNSY00240，No. 16ZXCXSF00040，No. X-2018-31)．

(責任編輯：孫立華)