沙菲菲　田軒　周浩雄　王家玉　郭云蔚

【摘要】目的 探討垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因1（PTTG1）在D-半乳糖胺（D-GalN）/TNF-α所致LO2肝細(xì)胞損傷中的變化，以及對(duì)細(xì)胞凋亡的影響和機(jī)制。方法 通過(guò)蛋白免疫印跡法和免疫組織化學(xué)檢測(cè)D-GalN/TNF-α作用前后LO2肝細(xì)胞中PTTG1的表達(dá)情況，使用PTTG1 shRNA慢病毒建立PTTG1干擾的LO2肝細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株，并通過(guò)蛋白免疫印跡法和RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白cleaved Caspase-3和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)基因糖調(diào)節(jié)蛋白（GRP 78）、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）的表達(dá)。結(jié)果 D-GalN/TNF-α作用于LO2肝細(xì)胞0.5 h后PTTG1蛋白表達(dá)開(kāi)始逐漸增加，1 h至24 h后PTTG1蛋白表達(dá)均高于未處理組（P均< 0.05）;與未處理組相比，D-GalN/TNF-α作用6 h后的LO2肝細(xì)胞免疫組織化學(xué)PTTG1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加（P均< 0.05）。與陰性對(duì)照組相比，PTTG1穩(wěn)定干擾的 LO2肝細(xì)胞中的cleaved Caspase-3及GRP 78、CHOP表達(dá)增加（P < 0.05）。結(jié)論 PTTG1在D-GalN/TNF-α所致的LO2肝細(xì)胞損傷中表達(dá)增加，且干擾PTTG1的表達(dá)可促進(jìn)LO2肝細(xì)胞凋亡并激活GRP 78/CHOP內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路。

【關(guān)鍵詞】垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因1;肝細(xì)胞損傷;凋亡;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

【Abstract】Objective To investigate the variation of pituitary tumor transforming gene 1 （PTTG1） expression in D-GalN/TNF-α-induced LO2 cell injury， evaluate the effect on cell apoptosis and unravel its underlying mechanism. Methods The expression levels of PTTG1 in the LO2 cells before and after D-GalN/TNF-αtreatment were detected by western blot and immunohistochemical staining. PTTG1-interfered LO2 cells were established by stably transfected with shRNA lentivirus targeting PTTG1 gene. The expression levels of apoptosis-related protein cleaved Caspase-3 and endoplasmic-reticulum-stress-related genes GRP 78 and CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein （CHOP） were determined by Western blot and RT-PCR. Results The expression of PTTG1 protein in the LO2 cells was gradually up-regulated at 0.5 h after treated with D-GalN/TNF-α， which was significantly higher than that in the untreated group at 1-24 h after treatment （all P < 0.05）. Compared with the value in the untreated group， the quantity of D-GalN/TNF-α-treated LO2 cells with positive PTTG1 was significantly increased （P < 0.05）. The expression levels of cleaved Caspase-3， GRP 78 and CHOP in the PTTG1-interfered LO2 cells were significantly higher compared with those in the negative controls （all P < 0.05）. Conclusions PTTG1 expression is up-regulated in D-GalN/TNF-α-induced LO2 cell injury. Interfering PTTG1 expression can promote the LO2 cell apoptosis and activate the GRP 78/CHOP endoplasmic reticulum stress signaling pathway.

【Key words】Pituitary tumor transforming gene 1;Liver cell injury;Apoptosis;

Endoplasmic reticulum stress

肝細(xì)胞損傷由多種因素如病毒感染、缺血缺氧、肝毒性物質(zhì)作用等引起，長(zhǎng)期肝損傷導(dǎo)致疾病向肝纖維化、肝硬化甚至肝癌發(fā)展。肝細(xì)胞凋亡對(duì)于清除外來(lái)刺激、維持穩(wěn)態(tài)和肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展都起著重要作用，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一[1]。垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因1（PTTG1）是于1997年在大鼠垂體腫瘤中首次被發(fā)現(xiàn)的癌基因，在正常人體大部分組織中低表達(dá)，而在許多腫瘤組織中表達(dá)顯著升高，如垂體瘤、甲狀腺癌、肝癌等[2-4]。PTTG1在細(xì)胞增殖、凋亡、DNA損傷修復(fù)等過(guò)程中起重要作用，其中，研究發(fā)現(xiàn)PTTG1對(duì)細(xì)胞凋亡的影響在不同的組織、細(xì)胞中既有誘導(dǎo)亦有抑制[5-7]。D-半乳糖胺（D-GalN）可通過(guò)增加肝細(xì)胞對(duì)肝毒性物質(zhì)的敏感性增強(qiáng)TNF-α的促凋亡作用[8]。本研究通過(guò)觀察PTTG1在D-GalN/TNF-α誘導(dǎo)的LO2人正常肝細(xì)胞損傷過(guò)程中的變化、干擾LO2肝細(xì)胞中PTTG1的表達(dá)并觀察其與細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系，探討PTTG1在LO2肝細(xì)胞損傷過(guò)程中的作用機(jī)制。

材料與方法

一、材 料

LO2人正常肝細(xì)胞系由中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)提供。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶和嘌呤霉素均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;D-GalN購(gòu)自Sigma公司;TNF-α購(gòu)自R&D公司;RNA快速提取試劑盒購(gòu)自奕杉生物;ReverTra? Ace cDNA合成試劑盒購(gòu)自TOYOBO公司;qRT-PCR SYBR Green Kit購(gòu)自南京諾唯贊生物科技公司。β-actin單克隆抗體購(gòu)自Sigma公司，PTTG1單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司，GRP 78 抗體購(gòu)自ABclonal公司 ，CHOP、cleaved Caspase-3及WB二抗購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。免疫組織化學(xué)（免疫組化）二抗購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司。PTTG1 shRNA慢病毒及陰性對(duì)照病毒由上海吉?jiǎng)P基因公司構(gòu)建。

二、方 法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)LO2肝細(xì)胞，置于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，0.25%胰酶消化后傳代、鋪板。在探究LO2肝細(xì)胞中PTTG1在D-GalN/TNF-α作用下的變化情況實(shí)驗(yàn)中，各處理組分別加入D-GalN （100 mg/ml）/TNF-α（40 ng/ml）處理0.5、1、6、12、24 h，設(shè)立不作處理的空白對(duì)照組。在細(xì)胞免疫組化染色實(shí)驗(yàn)中，處理組加入D-GalN（100 mg/ml）/TNF-α（40 ng/ml）作用6 h，空白對(duì)照組不做處理為未處理組。

2. 蛋白免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)

向各組細(xì)胞中加入適量含蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液，冰上裂解30 min后用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE分離蛋白，半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，加入對(duì)應(yīng)一抗后4℃孵育過(guò)夜，TBST沖洗，加入對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育2 h，TBST沖洗，ECL發(fā)光顯像。

3. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)mRNA表達(dá)

根據(jù)RNA快速提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度與濃度，逆轉(zhuǎn)錄后測(cè)定目的基因的引物序列見(jiàn)表1。

4. 細(xì)胞免疫組化染色

細(xì)胞爬片，處理組加入D-GalN/TNF-α刺激6 h，磷酸鹽緩沖液（PBS）浸洗，4%多聚甲醛固定20 min，PBS浸洗，0.5%Triton X-100室溫孵育15 min，PBS浸洗，3%H2O2孵育10 min，BSA封閉0.5 h，加入PTTG1單克隆抗體4℃濕盒孵育過(guò)夜，PBS浸洗，加入對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育2 h，PBS浸洗后DAB顯色，蘇木素染核。封片后于顯微鏡下放大200倍觀察，取隨機(jī)3個(gè)視野拍照、計(jì)數(shù)PTTG1免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并分析。

5. LO2肝細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建

根據(jù)shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)將3種PTTG1 shRNA慢病毒及陰性對(duì)照病毒轉(zhuǎn)染LO2肝細(xì)胞，低倍鏡下觀察到GFP熒光表達(dá)后，加入嘌呤霉素1 μg/ml進(jìn)行抗性篩選。擴(kuò)增細(xì)胞并取部分細(xì)胞通過(guò)蛋白免疫印跡法和RT-PCR測(cè)定PTTG1的干擾效果，挑選出最優(yōu)干擾PTTG1 shRNA慢病毒做下一步實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照病毒做陰性對(duì)照組。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

RT-PCR結(jié)果用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。采用Graph Padprism 8.0、SPSS 23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并作圖。正態(tài)分布數(shù)據(jù)以表示，2組數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);多組間比較采用方差分析，多重比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)或Dunnetts t3檢驗(yàn)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、D-GalN/TNF-α促進(jìn)LO2肝細(xì)胞的PTTG1表達(dá)

蛋白免疫印跡法灰度分析結(jié)果顯示，未處理組PTTG1/β-actin為0.48±0.11，D-GalN/TNF-α處理0.5、1、6、12、24 h后PTTG1/β-actin值依次

為0.59±0.15、0.83±0.14、0.85±0.084、0.89 ±0.10、0.88±0.10，1 h后各處理組PTTG1蛋白表達(dá)均高于未處理組（F = 6.805，P < 0.05;0.5h處理組與未處理組比較P > 0.05，1、6、12、24 h處理組與未處理組比較P均< 0.05）（圖1A）。D-GalN/TNF-α作用于LO2肝細(xì)胞6 h，免疫組化染色PTTG1陽(yáng)性率增加（t = -3.987，P < 0.05） （圖1B）。

二、PTTG1 shRNA慢病毒干擾的LO2肝細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建

3種PTTG1 shRNA慢病毒及陰性對(duì)照均成功感染LO2肝細(xì)胞，低倍鏡下可觀察到共表達(dá)的GFP熒光信號(hào)（圖2A）。RT-PCR和蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，PTTG1 shRNA-2的干擾效果最好

（F RT-PCR =245.908，F(xiàn)WB = 12.882，3種慢病毒感染組與陰性對(duì)照組比較P均< 0.05），可有效地沉默PTTG1基因（圖2B、C）。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將使用PTTG1 shRNA-2干擾后經(jīng)嘌呤霉素抗性篩選穩(wěn)定的LO2肝細(xì)胞進(jìn)行。

三、PTTG1基因沉默對(duì)LO2肝細(xì)胞凋亡的影響

蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，PTTG1穩(wěn)定干擾的LO2肝細(xì)胞中cleaved Caspase-3表達(dá)增加，灰度分析顯示蛋白相對(duì)表達(dá)量cleaved Caspase-3/β-actin值PTTG1干擾組為0.31±0.04，高于陰性對(duì)照組的0.21±0.02 （t = -4.484，P < 0.05）（圖3）。

四、PTTG1對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的影響

RT-PCR和蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照相比，PTTG1穩(wěn)定干擾的LO2肝細(xì)胞中GRP 78及CHOP的mRNA和蛋白表達(dá)均增加。RT-PCR結(jié)果顯示PTTG1干擾組GRP 78及CHOP的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.80±0.38、1.80±0.23，均高于陰性對(duì)照組的1.00±0.14、1.00±0.21（tGRP 78 = -4.421，tCHOP = -5.401，P均 < 0.05）（圖4A）;蛋

白免疫印跡法灰度分析結(jié)果顯示PTTG1干擾組GRP 78/β-actin及CHOP/β-actin值分別為0.92±0.03、0.42±0.59，均高于陰性對(duì)照組的0.56±0.04、0.18 ±0.04（tGRP 78/β-actin = -11.418，tCHOP/β-actin = -6.043，P均 < 0.05）（圖4B）。

討論

PTTG1是1997年首次被發(fā)現(xiàn)的癌基因，并被證實(shí)其為有絲分裂過(guò)程中介導(dǎo)姐妹染色單體分離的關(guān)鍵蛋白“分離酶抑制蛋白（securin）”[2， 9]。其主要位于胞漿中，小部分位于細(xì)胞核，在細(xì)胞增殖、DNA的損傷和修復(fù)、代謝、血管生成等生理過(guò)程中起重要作用[9-12]。PTTG1參與多種肝臟疾病發(fā)生發(fā)展。如HBV、HCV感染能促進(jìn)PTTG1的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄激活作用，其中PTTG1還可正向調(diào)控HBV，增強(qiáng)其表達(dá)和復(fù)制[13-16]。大量生物信息學(xué)分析表明，PTTG1在肝癌組織和正常組織中有顯著的差異表達(dá)，在信號(hào)通路富集分析中發(fā)現(xiàn)，肝癌中上調(diào)的差異表達(dá)基因主要富集的信號(hào)通路與代謝、細(xì)胞周期和生物氧化相關(guān)[17]。本研究證實(shí)PTTG1亦參與了D-GalN/TNF-α所導(dǎo)致的LO2肝細(xì)胞損傷的過(guò)程。

在各種因素導(dǎo)致的肝損傷性病變中，往往伴隨著肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生。凋亡又稱程序性死亡，是細(xì)胞保持自我穩(wěn)態(tài)的一種機(jī)制，對(duì)于維持自身的更新、清除外來(lái)刺激和受損細(xì)胞起著重要作用[18]。肝細(xì)胞凋亡過(guò)強(qiáng)或凋亡不足都會(huì)導(dǎo)致穩(wěn)態(tài)失衡，進(jìn)而導(dǎo)致各種急性、慢性肝臟疾病的發(fā)生。肝細(xì)胞凋亡主要涉及3個(gè)途徑：外在途徑、內(nèi)在途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）[1， 18-19]。ERS過(guò)程中激活未折疊蛋白反應(yīng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白通過(guò)結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP 78，促使其從3種跨膜受體蛋白PERK、IRE1、ATF6上解離，激活后者觸發(fā)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。在此過(guò)程中，前凋亡基因CHOP的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，而CHOP的過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[20]。

PTTG1對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，目前的研究表明其在不同的組織、細(xì)胞中作用不盡相同。干擾SH-J1肝癌細(xì)胞中PTTG1的表達(dá)后，細(xì)胞凋亡增加，并激活了p53[5]。同樣，干擾HepG2、SMCC-7721肝癌細(xì)胞系中PTTG1的表達(dá)亦促進(jìn)了細(xì)胞凋亡[21]。相反，在MCF-7乳腺癌細(xì)胞、HEK293細(xì)胞和p53突變型的PC-3人前列腺癌細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)，PTTG1的過(guò)表達(dá)通過(guò)p53依賴途徑促進(jìn)了細(xì)胞凋亡[7]。PTTG1對(duì)于細(xì)胞凋亡的影響是否存在組織或細(xì)胞特異性目前尚無(wú)定論，但研究至少表明PTTG1部分通過(guò)p53介導(dǎo)的信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響，同時(shí)還報(bào)道了PTTG1可通過(guò)p53非依賴途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡[7]。而本研究顯示，干擾PTTG1在LO2肝細(xì)胞中的表達(dá)，細(xì)胞凋亡增加，且上調(diào)了ERS通路GRP78/CHOP。我們推測(cè)，PTTG1基因在調(diào)控正常肝細(xì)胞急性損傷引發(fā)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中可能起到防止細(xì)胞凋亡過(guò)度的作用。

綜上所述，PTTG1參與了D-GalN/TNF-α所致的LO2肝細(xì)胞損傷過(guò)程且表達(dá)增加，其作用與ERS通路GRP 78/CHOP所致的細(xì)胞凋亡相關(guān)。PTTG1對(duì)細(xì)胞凋亡的影響是否在肝細(xì)胞中特異性地表現(xiàn)為抑制作用，及其生理和病理調(diào)控機(jī)制，本研究目前只在LO2人正常肝細(xì)胞上進(jìn)行了初步探討，后續(xù)將在其他正常肝細(xì)胞系和肝癌細(xì)胞系以及體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證。本研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步闡明PTTG1在肝臟疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制具有重要意義。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2019-12-25）

（本文編輯：楊江瑜）