徐夢(mèng)潔張昊晴李彩云侯帥黃東群雷冬竹*

1南華大學(xué)附屬郴州臨床醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心(郴州423000)

2郴州市第一人民醫(yī)院中心醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心(郴州423000)

耳聾是人類最常見的感覺功能障礙性疾病，在我國其發(fā)病率約1‰～3‰[1,2]，其中90%-95%的患者出生在聽力正常的家庭[3]。目前我國約有2780萬聽力殘疾人，約占?xì)埣踩巳旱?3.5%。耳聾的致病因素主要有遺傳因素和環(huán)境因素，約60%的耳聾患者為遺傳性耳聾[4]。遺傳性耳聾按遺傳方式可分為常染色體隱性遺傳、常染色體顯性遺傳、線粒體遺傳和性染色體連鎖遺傳[5]；按臨床表現(xiàn)分為綜合征型耳聾和非綜合征型耳聾，以耳聾為唯一癥狀的非綜合征型耳聾占遺傳性耳聾的70%[2]，其最常見的致聾基因有GJB2、SLC26A4、12S rRNA和GJB3[6,7]。研究顯示遺傳性耳聾基因致病變異分布存在地域差異[8]。本研究旨在探討郴州市正常聽力育齡婦女中4個(gè)常見遺傳性耳聾基因致病變異攜帶情況，提出可行的耳聾防控模式，以降低本地區(qū)出生缺陷率。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究將2017年3月-2019年5月就診于郴州市第一人民醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心的11055名聽力正常且無耳聾家族史的育齡女性納入研究范圍。

對(duì)受檢者進(jìn)行病史收集及體格檢查，包括詳細(xì)的家族史、藥物接觸史及潛在致聾因素。受檢者在充分知情同意情況下，簽署知情同意書。

研究方法和研究對(duì)象入組標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)郴州市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過。

1.2 研究方法

1.2.1 血液標(biāo)本采集

按照采血標(biāo)準(zhǔn)操作流程采取受檢者前臂外周血3-5ml，加入乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）抗凝，特殊醫(yī)用冰盒或4℃冰箱保存血樣。

1.2.2 DNA提取

使用磁珠提取純化試劑盒提取人血液中的基因組DNA。

1.2.3 聚合酶反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增

利用多重PCR技術(shù)擴(kuò)增富集人基因組DNA中靶序列并同時(shí)引入用于樣本識(shí)別的樣本標(biāo)簽序列。

1.2.4 文庫制備

多重PCR技術(shù)擴(kuò)增目的片段進(jìn)行純化后進(jìn)行物理打斷，然后在多種DNA聚合酶、連接酶、磷酸酶作用下對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行末端補(bǔ)平、3'端加“A”，完成特殊接頭在PCR產(chǎn)物兩端的連接，經(jīng)過磁珠純化完成文庫的制備。

1.2.5 文庫質(zhì)檢

打斷后2100檢測(cè)、文庫構(gòu)建完成后進(jìn)行2100、BMG檢測(cè)。

1.2.6 文庫pooling

根據(jù)文庫定量結(jié)果將多個(gè)文庫混合為1個(gè)上機(jī)文庫。

1.2.7 高通量測(cè)序

嚴(yán)格執(zhí)行BGISEQ-2000的操作規(guī)范，獲取序列堿基信息。

1.2.8 信息分析

測(cè)序下機(jī)后將數(shù)據(jù)上傳至大型機(jī)，信息分析人員根據(jù)樣本信息及其對(duì)應(yīng)的樣本標(biāo)簽信息、接頭信息等使用4個(gè)基因20個(gè)位點(diǎn)耳聾信息分析流程進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，通過相對(duì)數(shù)計(jì)量方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 育齡女性基因篩查結(jié)果

11055例聽力正常的育齡女性中，檢出448例耳聾基因致病變異攜帶者，包括6例SLC26A4雙雜合變異；7例GJB2和SLC26A4雙基因雜合變異攜帶者（見表1），總檢出耳聾基因變異位點(diǎn)460例，其攜帶率4.16%；檢出GJB2基因246例（2.22%,246/11055）、SLC26A4基因150例（1.36%，150/11055）、GJB3基 因 28例（0.25%,28/11055）和 線 粒 體12SrRNA基因36例（0.33%，36/11055），具體位點(diǎn)分布情況見表2。

2.2 配偶相應(yīng)基因驗(yàn)證結(jié)果

383例GJB2及SLC26A4基因致病變異育齡女性中，120例配偶知情選擇性行相應(yīng)基因檢測(cè)，其中72例未檢測(cè)致病變異；28例檢出良性或意義不明變異；20例檢測(cè)明確致病變異（見表3）。

2.3 產(chǎn)前診斷結(jié)果

20例夫婦攜帶同型致病變異，15例行知情選擇性產(chǎn)前診斷，其中3例胎兒未檢出致病變異；9例胎兒檢出單一變異；3例檢出復(fù)合雜合變異（見表4）；

2.4 家系分析與用藥指導(dǎo)結(jié)果

本研究中共檢出散發(fā)的線粒體12SrRNA致病變異36例，對(duì)所有受檢者進(jìn)行詳細(xì)的母系家系分析，推測(cè)至少378名成員可以通過臨床指導(dǎo)避免藥物性耳聾的發(fā)生。

表1 13例遺傳性耳聾基因雙雜合變異攜帶者的基因型及表型Table 1 Genotype and phenotype of 13 carriers of double heterozygousvariants of hereditary deafness gene

表2 435例聽力正常育齡女性4個(gè)基因變異頻率和構(gòu)成比Table 2 Frequency and composition ratio of 4 gene variants in 435 women with normal hearing age

2.5 隨訪結(jié)果

對(duì)263例配偶知情拒絕相應(yīng)基因檢測(cè)的GJB2或SLC26A4基因致病變異攜帶育齡女性的隨訪發(fā)現(xiàn)，122例育齡女性已分娩，其中1例c.235delA雜合變異攜帶者分娩1先天性耳聾患兒，2018年12月份于北京301醫(yī)院行耳蝸移植術(shù)，基因型為c.235delAC純合變異；2例c.235delC雜合變異攜帶者分娩1左耳聽力障礙患兒；1例c.919-2A＞G(IVS7-2A＞G)雜合變異攜帶者分娩兩個(gè)新生兒聽力篩查均未通過其余目前隨訪未發(fā)現(xiàn)有聽力異常。

對(duì)15例行產(chǎn)前診斷病例隨訪發(fā)現(xiàn)，3例檢出為復(fù)合雜合變異的胎兒中，2例知情選擇終止妊娠（c.109G＞A/c.235delC復(fù)合雜合變異和176-191del16/299-300delAT復(fù)合雜合變異）；1例（109G＞A/299-300 delAT復(fù)合雜合變異）選擇繼續(xù)妊娠，目前已順利分娩，目前聽力正常；其余12例新生兒聽力篩查均通過。

6例SLC26A4雙雜合變異育齡女性于我院耳鼻喉科聽力檢測(cè)中心進(jìn)行診斷性聽力檢測(cè)，通過應(yīng)用40Hz聽覺事件相關(guān)電位（40Hz AERP）和聽覺腦干誘發(fā)電位（ABR）進(jìn)行聽閾評(píng)估，結(jié)果如表5；后期追蹤隨訪了解6例受檢者目前均已生育，并且新生兒出生聽力均通過。需召回直系親屬行相關(guān)耳聾基因檢測(cè)，進(jìn)一步評(píng)估是否為復(fù)合雜合突變。

表3 120例攜帶基因變異的育齡女性配偶相關(guān)基因測(cè)序情況Table 3 Gene sequencing results of spouses of women in childbearing age with gene mutation

表4 15例行產(chǎn)前診斷家庭基因型分布情況及產(chǎn)前診斷結(jié)果Table 4 Genotype distribution and prenatal diagnosis results of 15 routine prenatal diagnosis families

表5 6例SLC26A4基因雙雜合變異攜帶者40HzAERP/ABR檢測(cè)結(jié)果Table 5 6 cases of SLC26A4 gene double heterozygousvariants variant carrier 40HzAERP/ABR test results

3 討論

耳聾是一種常見的出生缺陷。我國每年新增6-8萬耳聾患兒，60%為遺傳性耳聾[9]。隨著基因組研究技術(shù)不斷發(fā)展，目前發(fā)現(xiàn)與非綜合型耳聾相關(guān)的基因超過80個(gè)，涉及到1000多個(gè)致病變異和100多個(gè)相關(guān)基因片段[10]。我國遺傳性耳聾基因致病變異人群攜帶率為6.3%，其中GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA及GJB3基因占主導(dǎo)地位，占70%[11]。2017年Chen等精選14項(xiàng)遺傳性耳聾4個(gè)基因20個(gè)位點(diǎn)篩查研究（共131158名新生兒）進(jìn)行meta分析顯示，20個(gè)位點(diǎn)攜帶率達(dá)4.70%[6]，較本研究中稍高(4.17%)。

GJB2基因是最常見的耳聾致病基因[12]，本地區(qū)育齡女性的GJB2基因變異攜帶率為2.22%，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]。其中c.235delC變異位點(diǎn)在耳聾患者及聽力正常人群檢出率均居首位[12-14]，本地區(qū)也為最高，達(dá)1.75%，其次是c.299-300delAT，達(dá)0.41%。而歐洲和美國中西部最常見的致病變異位點(diǎn)c.35delG[15]，該位點(diǎn)在本地區(qū)未檢出。本研究對(duì)GJB2基因攜帶女性的配偶的檢查發(fā)現(xiàn)c.109G＞A檢出率居于首位，達(dá)11.67%，其中包含2例為c.109G＞A純合變異。該純合變異在聽力正常及輕度受損的小鼠及人中可檢出[16-17]。并且c.109G＞A位點(diǎn)與c.235delC及c.299-300delAT形成復(fù)合雜合變異可導(dǎo)致輕中度聽力感音性神經(jīng)性耳聾[18]。近年研究顯示c.109G＞A普遍存在于亞洲人群中，在日本其檢出率僅次c.235delC[19]。而c.109G＞A位點(diǎn)目前尚未納入本地區(qū)常規(guī)遺傳性耳聾篩查范圍，這也就意味著有一部分相關(guān)基因攜帶者存在漏篩風(fēng)險(xiǎn)。我國2019年遺傳性耳聾基因篩查專家共識(shí)建議，對(duì)育齡女性進(jìn)行遺傳性耳聾基因篩查及對(duì)夫婦同型致病基因攜帶的孕婦行產(chǎn)前診斷可避免先天性耳聾患兒的出生[11]。本地區(qū)GJB3基因攜帶率為0.25%，該基因被認(rèn)為與顯性遺傳高頻聽力下降有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)GJB3和GJB2基因在致聾方面存在相互作用，推測(cè)與致病機(jī)理相關(guān)，均影響編碼的縫隙連接蛋白[20-21]。巫靜帆等[12]研究發(fā)現(xiàn)1例c.235delCIVS7-2A＞G雙雜合突變確診為耳聾患者，本研究中檢出7例GJB2/SLC26A4雙基因突變育齡女性聽力均正常，結(jié)果符合多數(shù)研究中GJB2/SLC26A4雙基因雜合變異個(gè)體聽力不受影響的觀點(diǎn)[7,12]。

SLC26A4基因變異通過影響內(nèi)耳內(nèi)淋巴穩(wěn)態(tài)失衡導(dǎo)致后天中度以上感音神經(jīng)性耳聾[22-23]。SLC26A4基因是僅次于GJB2基因的致病基因[24]，本地區(qū)攜帶率為1.50%，其在中東和亞洲耳聾患者中檢出率較歐洲地區(qū)高[25]。其中c.919-2A＞G（IVS7-2A＞G）位點(diǎn)攜帶率為0.85%，僅次于GJB2基因的c.235delC位點(diǎn)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[12-14]。本研究檢出6例SLC26A4基因雙雜合變異，目前尚未完善受檢者家系驗(yàn)證，暫時(shí)無法確認(rèn)是否為復(fù)合雜合變異。其表現(xiàn)為聽力正常可能原因?yàn)椋?.復(fù)合雜合變異，由于不同位點(diǎn)具有遺傳異質(zhì)性，該6例育齡女性尚未進(jìn)展為聽力受損；2.雙雜合變異，兩個(gè)位點(diǎn)位于同一染色體，屬于連鎖關(guān)系，不引起聽力障礙。SLC26A4基因相關(guān)耳聾患者出生時(shí)新生兒聽力篩查一般表現(xiàn)為正常，易被忽視，攜帶者篩查是避免SLC26A4基因相關(guān)后天性遺傳性耳聾出生缺陷發(fā)生的重要手段。

線粒體DNA上的12S rRNA變異可引起以母系遺傳為主的遺傳性耳聾。其致病機(jī)制為m.1555A＞G或m.1494C＞T變異導(dǎo)致線粒體的12S rRNA編碼區(qū)形成類似氨基糖苷類藥物作用靶點(diǎn)的結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)接觸氨基糖苷類抗生素，蛋白質(zhì)合成異常導(dǎo)致耳蝸線粒體功能不可逆障礙，造成永久性聽力障礙[26]。線粒體12S rRNA基因篩查及時(shí)發(fā)現(xiàn)攜帶者，對(duì)母系成員進(jìn)行用藥指導(dǎo)能有效避免藥物性耳聾發(fā)生。

基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展推動(dòng)了遺傳性耳聾分子診斷學(xué)的發(fā)展[27]。目前最適宜的耳聾篩查模式是對(duì)育齡女性進(jìn)行遺傳性耳聾基因攜帶者篩查、對(duì)新生兒進(jìn)行物理聽力篩查聯(lián)合遺傳性耳聾基因篩查。本研究通過攜帶者篩查成功避免了2例遺傳性耳聾患兒的出生。另外，遺傳性耳聾知識(shí)科普也十分重要，目前國內(nèi)36.3%接受過高等教育的人認(rèn)為他們不可能生育先天性耳聾患兒[9]。在地方建立適宜的遺傳性耳聾基因篩查模式，通過宣傳冊(cè)，媒體等多方面渠道進(jìn)行人群遺傳性耳聾疾病宣傳，才能實(shí)現(xiàn)降低遺傳性耳聾出生缺陷的目標(biāo)。