李進關(guān)靜張靜謝林怡熊芬蘭蘭王秋菊*

1浙江中醫(yī)藥大學（杭州310053）

2中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學部，國家耳鼻咽喉疾病臨床醫(yī)學研究中心，解放軍耳鼻咽喉研究所，聾病教育部重點實驗室；聾病防治北京市重點實驗室（北京100853）

Waardenburg Syndrome（WS），即瓦登伯格綜合征，又稱色素-聽力綜合征，是常見的耳聾綜合征之一，發(fā)病率約1/42000，占先天性聾的2%-5%[1]。主要臨床癥狀包括先天性感音神經(jīng)性聾、虹膜色素異常、毛發(fā)皮膚色素異常等；根據(jù)不同特征性表現(xiàn)分為Ⅰ-Ⅳ四個亞型，分別為WS1-WS4，WS1伴內(nèi)眥異位，WS2不伴內(nèi)眥異位，WS3合并上肢異常，又稱Klein-Waardenburg綜合征，WS4常伴先天性巨結(jié)腸等胃腸道畸形及周圍神經(jīng)脫髓鞘病變、中樞髓鞘形成障礙等神經(jīng)病學改變，又稱Waardenburg-Shah綜合征（https://ghr.nlm.nih.gov/condition/waardenburg-syndrome#）。WS遺傳方式包括常染色體顯性遺傳和常染色體隱性遺傳，目前已發(fā)現(xiàn)6個與WS相關(guān)的致病基因，分別為MITF、PAX3、EDNRB、EDN3、SOX10及SNAI2（https://hereditaryhearingloss.org/ws），且不同基因與不同亞型相關(guān)，其中PAX3基因（paired box 3）（OMIM：606597）是發(fā)現(xiàn)的第一個WS相關(guān)基因，還與顱面-聾-手綜合征（craniofacial-deafness-hand syndrome，CDHS）及腺泡狀橫紋肌肉瘤相關(guān)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/5077）。本研究在12例疑似WS患者中檢出5例PAX3基因的變異，本文將對這5個家庭的基因型與表型特征進行如下分析。

1 研究對象

對本課題組2017-2018年間收集的疑似WS患者進行耳聾基因檢測，對檢出PAX3基因突變的5名患者及其家庭進行分析（圖1-4）。所收集的5名患者分別來自遼寧、山東、江蘇、河北，4名具有家族遺傳史，1名為散發(fā)患者；5名患者包括1名男性及4名女性；就診年齡4名為嬰幼兒或兒童（0-6歲），1名為成年人（31歲）。4個有家族遺傳史的家系中，共收集先證者及家庭成員血樣18份，其中有WS相關(guān)表現(xiàn)者10人；1個疑似新生突變患者家庭中，僅收集到先證者及其母親血樣。所有研究對象均為漢族，均簽署知情同意書。

圖1 家系1基因型與表型A.家系圖：箭頭所指為先證者；WT表示基因檢測無突變，Het表示雜合突變；B.眼睛外觀圖：從上至下依次為Ⅰ-1、Ⅱ-2、Ⅲ-1眼睛外觀圖，分別為雙側(cè)藍虹膜、左側(cè)藍虹膜、右側(cè)藍虹膜，Ⅱ-2、Ⅲ-1雙眼間距較寬；C.Ⅰ-1、Ⅱ-1的Sanger測序驗證結(jié)果；D.II-2純音測聽，提示左側(cè)極重度聽力損失Fig.1 Genotype and phenotype of Family 1.A.Pedigree:The proband is indicated by an arrow.WT and Het represents wild type and Heterozygous,respectively.B.Appearance of patients:Ⅰ-1 shows bilateral blue iris,Ⅱ-2 shows left blue iris andⅢ-1 shows right blue iris.Ⅱ-2 andⅢ-1 show widened interpupillary distance.C.Sequencing chromatograms ofⅠ-1,Ⅱ-1.D.Audiogram of II-2 shows severe hearing loss in left ear.

圖2 家系2基因型與表型A.家系圖：箭頭所指為先證者；WT表示基因檢測無突變，Het表示雜合突變；B.Sanger測序結(jié)果，從上至下依次為Ⅰ-2、Ⅱ-1；C.表示先證者純音測聽，提示雙側(cè)極重度感音神經(jīng)性聽力損失Fig.2 Genotype and phenotype of Family 2.A.Pedigree:The proband is indicated by an arrow.WT and Het represents wild type and Heterozygous,respectively.B.Sequencing chromatograms ofⅠ-2 andⅡ-1 shows WT and Het genotype,respectively.C.Audiogram of II-1 show bilateral severe hearing loss.

圖3 家系3基因型與表型A.家系圖：箭頭所指為先證者；WT表示基因檢測無突變，Het表示雜合突變；B.Sanger測序結(jié)果，從上至下依次為Ⅰ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3、Ⅱ-4、Ⅲ-3；C.Ⅱ-3純音測聽結(jié)果顯示右側(cè)低頻聽力下降Fig.3 Genotype and phenotype of Family 3.A.Pedigree:The proband is indicated by an arrow.WT and Het represents wild type and Heterozygous,respectively.B.Sequencing chromatograms ofⅠ-1,Ⅱ-2,Ⅱ-3,Ⅱ-4 and Ⅲ-3.C.Audiogram of II-3 shows hearing loss at low frequency in right ear.

圖4 家系4-5基因型與表型：箭頭所指為先證者；WT表示基因檢測無突變，Het表示雜合突變；A.家系4家系圖，III-2為先證者，先證者、II-2及II-3有WS表現(xiàn)；B.家系4中II-3純音測聽提示左側(cè)極重度感音神經(jīng)性聽力損失；C.家系4樣本Sanger測序結(jié)果D.家系5家系圖，II-1為先證者，先證者及I-1有WS表現(xiàn)；E.家系5樣本Sanger測序結(jié)果；F.保守性預(yù)測，可見該位置氨基酸高度保守Fig.4 Genotype and phenotype of Family 4 and Family 5.The proband is indicated by an arrow.WT and Het represents wild type and Heterozygous,respectively.A.Pedigree of the Family 4.The proband(III-2),II-2 and II-3 are WS patients.B.Audiogram of II-3 from Family 4 shows severe hearing loss in left ear.C.Sequencing chromatograms ofⅡ-2,Ⅱ-3,Ⅱ-4 andⅢ-2 from Family 4.D.Pedigree of the Family 5.The proband(II-1)and I-1 are WS patients.E.Sequencing chromatograms of I-1,II-1 andⅡ-1 from Family 5.F.The arginine,terminated at position of 222 of PAX3,is evolutionarily conserved among different species.

2 研究方法

2.1 臨床資料收集及聽力學評估

對患者進行詳細問診及體格檢查，記錄病史及家族史，包括皮膚、毛發(fā)、四肢、眼科、耳科等，并繪制家系圖譜；使用抗凝管抽取4-5ml靜脈血，置于-80℃保存?zhèn)溆?；對患者進行聽力學檢查，包括純音測聽、聲導(dǎo)抗、畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射（DPOAE）、聽性腦干反應(yīng)（ABR）潛伏期，對無法配合主觀測聽的兒童及嬰幼兒增加聽性腦干反應(yīng)閾值、40Hz聽覺事件相關(guān)電位（40Hz AERP）及聽覺穩(wěn)態(tài)反應(yīng)（ASSR）。根據(jù)500、1000、2000、4000Hz平均聽閾計算聽力損失程度，分為輕度（26-40 dB HL）、中度（41-55 dB HL）、中重度（56-70 dB HL）、重度（71-90 dB HL）以及極重度（＞90 dB HL）聽力損失。

2.2 基因檢測及Sanger驗證

抽取先證者及家系成員（共20名）外周靜脈血，利用天根生化科技（北京）有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取，對先證者進行已知的127個候選基因的遺傳性耳聾基因檢測（NGS Panel），并在先證者及家系相關(guān)成員中進行Sanger驗證。依據(jù)《遺傳變異分類標準與指南》（ACMG指南）[2]明確突變的致病性。進行基因型表型的對比分析。

3 結(jié)果

3.1 臨床表型

5名PAX3突變相關(guān)WS中，4名為家族遺傳性，1名否認家族遺傳史，疑似新發(fā)變異。4個家系中，先證者均為極重度感音神經(jīng)性聽力損失，2名雙側(cè)，2名單側(cè)；均存在虹膜異色，2名雙側(cè)，2名單側(cè)；3名存在內(nèi)眥間距異常。對先證者及親屬進行追訪，共記錄10名患者，8名（80%，8/10）存在聽力損失，其中6名（75%，6/8）為單側(cè)；9名（90%，9/10）存在虹膜異色，其中4名（44.4%，4/9）為單側(cè)。另外，部分患者存在額白發(fā)、一字眉等表現(xiàn)，均不存在皮膚色素異常。疑似新發(fā)變異患者為雙側(cè)極重度感音神經(jīng)性聽力損失，雙側(cè)虹膜色素異常，且有鼻部形態(tài)異常及手指彎曲、肘關(guān)節(jié)突出（表1）。

3.2 基因檢測結(jié)果及分析

5例PAX3相關(guān)WS患者中，共檢測到4種突變，包括1例內(nèi)含子剪切位點變異，1例錯義突變及3例無義突變；5例患者中，4例有明確家族史，1例無家族史。對這4個具有家族遺傳性的先證者及其家屬共18名（10例患者，8例正常人）進行Sanger驗證，結(jié)果表明有WS表現(xiàn)者均為雜合突變，基因型與表型共分離，符合顯性遺傳特征。家系1（圖1）為PAX3基因6號內(nèi)含子上發(fā)生的堿基替換c.958+75A＞G(NM_181457.3)，該變異尚無文獻報道，根據(jù)ACMG指南，判斷為意義未明變異。家系3檢出c.790C＞T(p.Gln264*，NM_181457.3)，家系4和5均檢出c.664C＞T(p.Arg222*，NM_001127366)，這2種無義突變既往多次在WS1患者中報道[3-5]，為致病變異。家系2（圖2）先證者為PAX3基因c.141C＞A（p.Asn47Lys，NM_181457.3）錯義突變，該變異曾在一個CDHS家系中報道[6]，而相同位置p.Asn47His曾在WS3[7]患者中檢測到。值得注意的是，此患者否認家族史，我們在已獲得的母親樣本中未檢測到相同變異，因患者父親樣本無法提供，我們無法確認突變來源。但并不排除患者的致病突變?yōu)樾律蛔兊目赡苄浴?/p>

4 討論

PAX3基因位于2號染色體，編碼PAX3轉(zhuǎn)錄因子，具有高度保守性[8]。PAX3轉(zhuǎn)錄因子包括N端DNA結(jié)合區(qū)(含配對盒結(jié)構(gòu)域PD和同源結(jié)構(gòu)域HD)、八肽基序及C端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，DNA結(jié)合區(qū)行使主要功能[9]。PAX3基因突變可造成黑素細胞合成異常、神經(jīng)嵴發(fā)育異常，從而造成毛發(fā)皮膚低色素、虹膜異色以及顱面骨骼、牙齒及四肢等異常，故可表現(xiàn)為WS或CDHS。約80%的WS1患者可檢出PAX3的突變，WS3也與PAX3相關(guān)[8,10]；目前已報道的PAX3的WS相關(guān)變異有100余種（https://grenada.lumc.nl/LOVD2/WS/home.php?select_dp=PAX3），包括錯義突變、無義突變、剪切位點變異、移碼突變等，突變多位于第2～6外顯子[11]，可能改變了PD和HD功能的完整性，從而影響PAX3轉(zhuǎn)錄因子的功能，且純合突變的表型多比雜合突變嚴重[12]。本文通過對12例疑似WS患者進行基因檢測，發(fā)現(xiàn)5例PAX3基因突變相關(guān)患者，顯性遺傳4例及疑似新生變異1例，包括4種突變類型，分別為c.958+75A＞G、c.141C＞A(p.Asn47Lys)、c.790C＞T(p.Gln264*)及c.664C＞T(p.Arg222*)，其中c.958+75A＞G為本次發(fā)現(xiàn)的WS相關(guān)新變異。

PAX3基因突變導(dǎo)致的WS表型多樣且具有異質(zhì)性。本文4個顯性遺傳家系的10名患者中，8名為WS1，2名有輕微的手指關(guān)節(jié)異常；1名疑似新生突變患者為WS3，存在手指彎曲及肘關(guān)節(jié)突出。Song[13]等報道，PAX3突變患者中50%存在聽力損失，本研究收集家系主要因先證者耳聾進行門診咨詢，家系患者中聽力異常比例較高，4個顯性遺傳家系中基因檢測陽性者共10人，其中8人（80%，8/10）具有單側(cè)或雙側(cè)感音神經(jīng)性聾，且多為先天性極重度聽力損失；虹膜色素異常、內(nèi)眥異位及額白發(fā)亦為常見癥狀。對于皮膚色素異常，Magnolia[3]等在19例PAX3突變相關(guān)WS巴西患者中觀察到6例有皮膚白斑，Clinton[4]等也有報道，而中國人群相關(guān)報道較少發(fā)現(xiàn)[10]，本研究患者也未觀察到皮膚色素異常，提示皮膚色素異常在中國人群可能較少發(fā)生。另外，家系中患者存在外顯率的差異。如家系1（圖1）中，不同患者聽力損失及虹膜色素異常的表現(xiàn)不同；部分家系WS外顯率差異較大[14]，表型輕微的常被患者忽視，如家系5（圖4B）中，I-1內(nèi)眥間距寬、并眉的表型被其忽視，提示對WS家系成員問診與查體需要全面，同時應(yīng)注意遺傳學的驗證。

PAX3同一氨基酸的改變可造成不同表型。本研究患者2為WS3，檢出p.Asn47Lys，與Sommer在CDHS家系中檢出的突變相同[6]；另外，Sheffer曾在相同位置檢出p.Asn47His，表現(xiàn)為WS3[7]。三個家系患者表型有相似也有不同。本家系3中檢出的突變?yōu)閜.Gln264*，表現(xiàn)為WS3，與Regina等在巴西WS1患者中報道的一例新生突變一致[3]。家系4，5的無義突變p.Arg222*在美國家系及中國散發(fā)病例中均有報道[4,5]，可能是WS較常見的突變位點之一，表型也不盡相同。由此可見PAX3同一位置密碼子的相同及不同改變均可造成表型的多樣性，可能是氨基酸的不同改變對下游基因及修飾基因等可造成不同的影響，且環(huán)境因素對表型也有影響，具體仍需進一步探究。

PAX3突變導(dǎo)致的WS目前尚無有效藥物進行治療，面部畸形及耳聾可行手術(shù)干預(yù)。上述CDHS家庭中患者通過手術(shù)改善了鼻部外形、矯正了手指偏曲[15]。聽力損失可能是由于黑素細胞異常導(dǎo)致耳蝸血管紋功能異常最終導(dǎo)致感音神經(jīng)性聾，可采取人工耳蝸植入進行干預(yù)[16,17]。本研究對WS患者進行電話隨訪時，多數(shù)家屬表示患者虹膜異色但視力未發(fā)現(xiàn)異常，對正常生活無較大影響，而聽力問題亟待解決。本研究中，單側(cè)聽力損失的患者未行相關(guān)醫(yī)療干預(yù)；3名雙側(cè)聽力損失患者中，家系4先證者于13個月時行單側(cè)人工耳蝸植入，現(xiàn)7歲，效果較好；家系5先證者單側(cè)人工耳蝸植入時間為3歲，現(xiàn)4.5歲，效果欠佳；家系2患者未予干預(yù)，現(xiàn)已成年，只能使用手語交流?？梢妼τ赪S雙側(cè)聽力損失者，應(yīng)盡早診斷與干預(yù)，因聽力損失多為極重度，人工耳蝸植入可能是有效手段；單側(cè)聽力損失者，如患耳存在殘余聽力，需關(guān)注患側(cè)聽力變化，同時更應(yīng)注意保護健側(cè)耳。

PAX3基因突變導(dǎo)致的WS以顯性遺傳為主，也存在新生突變，且表型具有一定異質(zhì)性，同家系成員間外顯率也不同，需要臨床遺傳咨詢予以注意。對于有WS家族史的家系應(yīng)擴大家族成員樣本采集，進行全面的問診和查體，主要診斷標準和次要診斷標準均需注意，同時需要對先證者及家庭相關(guān)成員行基因檢測，明確分子病因，評估再發(fā)風險；對于否定家族史患者，應(yīng)當對父母進行驗證，明確是否為新生變異，以更好進行遺傳咨詢與指導(dǎo)。