郝俊玫，王亞男，錢瑞華，李海贏，武靖松，馬丹煒

四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都 610101

土荊芥(C.ambrosioides)為藜科一年或多年生草本植物[1]，廣泛分布于世界溫帶至熱帶地區(qū)，在我國南方和北方的大部分地區(qū)均有分布[2]。土荊芥全株含有豐富的揮發(fā)油、黃酮、生物堿等，具有抗菌、抑蟲、抗腫瘤和抗氧化等功效[3,4]。在抗腫瘤方面，土荊芥葉醇提物可抑制腹腔內(nèi)艾氏固體瘤和腹水瘤的形成，顯著提高荷瘤小鼠存活率[5]；全株醇提物可抑制MCF-7細(xì)胞增殖[6]；在土荊芥的不同器官中，所含黃酮類物質(zhì)成分差異較大，從種子中提取的次生代謝產(chǎn)物含量高于根和莖[7,8]。

在植物次生代謝物質(zhì)的提取方面，提取溶劑對(duì)提取物的成分影響較大，對(duì)其抗腫瘤活性方面影響也較大。Zeng等[9]研究長(zhǎng)根靜灰球不同溶劑提取物的體外抗腫瘤作用，發(fā)現(xiàn)正丁醇提取物對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞活力有較明顯的抑制作用；不同溶劑海芋提取物抗腫瘤效果也不盡相同，乙酸乙酯和丙酮提取物有較好的細(xì)胞毒活性，而海芋的環(huán)己烷、石油醚、乙醇和水提物對(duì)各種細(xì)胞株的IC50劑量都比較大[10]。有關(guān)不同溶劑對(duì)土荊芥提取物成分及其抗腫瘤活性成分的影響報(bào)道較少，本研究選用不同極性有機(jī)溶劑石油醚、乙酸乙酯、正丁醇以及蒸餾水單獨(dú)或依次為溶劑，采用微波超聲波組合合成/萃取儀提取四川產(chǎn)土荊芥種子總黃酮，采用HPLC法測(cè)定其槲皮素和山奈酚的含量，MTT法評(píng)價(jià)其抗腫瘤活性，以期篩選土荊芥種子總黃酮最佳提取條件，為四川產(chǎn)土荊芥作為潛在抗腫瘤藥物的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

土荊芥于2016年9月下旬在四川省成都市凈居寺的廢棄荒地采集，經(jīng)四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院馬丹煒教授鑒定為藜科藜屬植物土荊芥(C.ambrosioides)。將采集的土荊芥植株置于陰涼通風(fēng)處，曬干后收集其種子，磨碎放于密封袋中備用。

人正常肝L02細(xì)胞、人宮頸癌Hela細(xì)胞、人肝癌HepG2、Hep3b細(xì)胞、SMMC-7721和人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞均由四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器與試劑

祥鵠電腦微波超聲波組合合成/萃取儀(北京祥鵠科技發(fā)展有限公司)；Algilent Technologies高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；

石油醚、乙酸乙酯、正丁醇(成都科龍化工試劑廠)；槲皮素、山奈酚(西安天美生物科技公司)；噻唑藍(lán)(MTT，Biosharp生物公司)；5-氟尿嘧啶(中國食品藥品檢定研究院)；鬼筆環(huán)肽(上海翊圣生物科技有限公司)。

1.3 土荊芥種子總黃酮的制備與純化

稱取40 g土荊芥種子，按料液比1∶6加入溶劑，浸泡1 h，微波為300 Hz，超聲波為275 Hz，微波與超聲波比例為1∶2。其它條件如表1所示，得到S1～S7提取物。采用D101大孔吸附樹脂純化S1～S7提取物，收集液再次用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾，并進(jìn)行真空干燥。

表1 土荊芥種子總黃酮提取方法

注：S1:石油醚提取物；S2:乙酸乙酯提取物；S3:正丁醇提取物；S4:蒸餾水提取物；S5:石油醚-乙酸乙酯依次提取物；S6:石油醚-乙酸乙酯-正丁醇依次提取物；S7:石油醚-乙酸乙酯-正丁醇-蒸餾水依次提取物，下同；“+”使用該溶劑提??；“-”表示不使用該溶劑提取。

Note:S1:Petroleum ether extract;S2:Ethyl acetate extract;S3:Butyl alcohol extract;S4:Distilled water extract;S5:Petroleum ether-ethyl acetate sequential extract;S6:Petroleum ether-ethyl acetate-butyl alcohol sequential extract;S7:Petroleum ether-ethyl acetate-butyl alcoho-distilled water sequential extract.

1.4 土荊芥種子總黃酮含量測(cè)定

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

按Qian等[3]的方法配置標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照紫外-可見分光光度法，在波長(zhǎng)510 nm測(cè)定其吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)(Y)，濃度為橫坐標(biāo)(X)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

1.4.2 樣品總黃酮含量測(cè)定

分別稱取純化后的S1～S7提取物各0.2 g，配制濃度為2 mg/mL的母液。量取上述各樣品母液1 mL，同“1.4.1”中蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方法，按照紫外-可見分光光度法，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定其吸光度值，并根據(jù)線性回歸方程計(jì)算各樣品中總黃酮類物質(zhì)含量[3]。

1.5 土荊芥種子總黃酮中槲皮素和山奈酚含量測(cè)定

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制和線性曲線的確定

以甲醇為溶劑，配制濃度為200 μg/mL的槲皮素標(biāo)品母液和300 μg/mL的山奈酚標(biāo)品母液，備用。兩種標(biāo)品溶液的配制見表2。

表2 槲皮素和山奈酚標(biāo)品溶液濃度

將0.1%甲酸用抽濾泵經(jīng)有機(jī)濾膜抽濾后放入超聲波清洗儀中進(jìn)行脫氣，以相同的方法處理100%乙腈。然后分別用0.1 %甲酸、100%乙腈沖柱，流速為3.00 mL/min，再用100%乙腈沖基線至平滑。

按以下色譜條件進(jìn)樣：C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為25 ℃；乙腈-0.1%甲酸(35∶65)作為流動(dòng)相，柱流量為1.0 mL/min；在波長(zhǎng)為360 nm處進(jìn)行檢測(cè)。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得其回歸方程[11]。

1.5.2 樣品總黃酮溶液的配制

分別稱取純化后的S1～S7提取物，用溶液配制濃度為200 mg/mL的溶液。進(jìn)樣的色譜條件同“1.5.1”中槲皮素和山奈酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)方法，在波長(zhǎng)360 nm處測(cè)定其對(duì)應(yīng)峰面積值，并根據(jù)線性回歸方程計(jì)算各樣品中槲皮素和山奈酚的物質(zhì)含量[12]。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)

L02、SMMC-7721、HepG2、Hep3b、Hela和HT29細(xì)胞分別接種在加有10%新生牛血清的改良型1640培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基中，在5% CO2、37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于試驗(yàn)。

1.7 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

制備上述6株細(xì)胞的細(xì)胞懸液，以濃度8×104個(gè)/mL、每孔100 μL接種于96孔板中。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，每孔加100 μL新鮮培養(yǎng)基，按照表3加入2 μL不同濃度的土荊芥種子提取物溶液。各濃度重復(fù)5次，設(shè)置溶劑對(duì)照(1% DMSO)、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照(80 μg/mL 5-氟尿嘧啶)。共培養(yǎng)24 h后，加入20 μL MTT培養(yǎng)4 h，除上清，加150 μL DMSO。酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的吸光度A值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(細(xì)胞增殖抑制率=[1-A處理組/A溶劑對(duì)照]×100%)。

表3 各樣本處理濃度

注：對(duì)照組：1% DMSO；S1～S7同表1。

Note:Control:1% DMSO;S1-S7 are the same as Table 1.

1.8 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

制備濃度為4×105個(gè)/mL的SMMC-7721細(xì)胞的細(xì)胞懸液，以每孔1 mL接種在6孔板上。5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，每孔加1 mL新鮮培養(yǎng)基，并加入20 μL S6溶液，使其終濃度分別為0.1、0.3和0.7 mg/mL，并設(shè)置溶劑對(duì)照(1% DMSO)。培養(yǎng)24 h后，用倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.9 細(xì)胞集落形成試驗(yàn)

前期SMMC-7721細(xì)胞的培養(yǎng)和不同濃度S6溶液的處理方法同“1.8”，同時(shí)設(shè)置溶劑對(duì)照(1% DMSO)。各濃度的S6溶液作用SMMC-7721細(xì)胞后，孵育至明顯觀察到細(xì)胞集落，除上清，PBS清洗，2.5%戊二醛溶液固定20 min，PBS清洗3次，Giemsa染液染色30 min，PBS清洗6孔板直至完全脫色后，倒置顯微鏡觀察，并拍照。

1.10 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞骨架

SMMC-7721細(xì)胞的培養(yǎng)和不同濃度S6溶液的處理方法同“1.8”，并設(shè)溶劑對(duì)照(1% DMSO)。各濃度的S6溶液作用SMMC-7721細(xì)胞24 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗后，每孔加濃度為1%的Triton X-100/M緩沖液1 mL，在25 ℃下靜置20 min；棄去Triton X-100/M緩沖液，再次用PBS清洗10 min，重復(fù)3次；2.5% 的戊二醛固定(4 °C、15 min)，再次用PBS清洗3次；200 μM鬼筆環(huán)肽染色20 min，PBS重復(fù)清洗3次后，使用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0處理數(shù)據(jù)，單因素ANOVA方差分析顯著性差異(P<0.05)，使用Microsoft Excel 2003和GraphPad Prism 7.04作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 土荊芥種子提取物總黃酮提取率及含量測(cè)定

選用不同極性溶劑，采用微波超聲波輔助萃取土荊芥種子總黃酮，D101大孔吸附樹脂純化粗提物，最后得率見表4，S6的提取率最高為3.97%，S1的提取率最低為0.28%。黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，其回歸線方程為Y= 0.005 8X-0.000 4，R2=0.999 9，線性范圍為0～50 μg/mL。S1～S7中總黃酮含量見表4，S6中總黃酮含量最高為96.39 mg/g。

2.2 土荊芥種子總黃酮中槲皮素和山奈酚含量分析

采用高效液相色譜儀對(duì)梯度稀釋后的不同濃度槲皮素和山奈酚標(biāo)品溶液進(jìn)行分析，槲皮素和山奈酚標(biāo)準(zhǔn)曲線分別如圖2(A)和2(B)所示，并根據(jù)濃度和峰面積計(jì)算線性回歸方程，槲皮素標(biāo)品的線性回歸方程為Y=35.188 79X-2.886 93e-1，相關(guān)性R2=0.999 94，殘留標(biāo)準(zhǔn)誤差為3.036 39，出峰保留時(shí)間為6.940 min；山奈酚標(biāo)品的線性回歸方程為Y=14.957 23X-4.291 25，相關(guān)性R2= 0.999 94，殘留標(biāo)準(zhǔn)誤差為3.778 41，出峰保留時(shí)間為11.756 min。

表4 不同溶劑土荊芥種子總黃酮的提取率及含量

圖1 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of flavonoids

如表5結(jié)果所示，S1～S7中槲皮素和山奈酚的含量不同。S2中槲皮素含量最高為0.602 mg/g，S6中槲皮素含量次之，為0.531 mg/g，S5和S3中槲皮素含量分別為0.481和0.412 mg/g；S6中山奈酚的含量最高，為0.479 mg/g。而S1、S4和S7樣品中未檢測(cè)到槲皮素和山奈酚的成分。

2.3 土荊芥種子總黃酮對(duì)6株供試細(xì)胞增殖的抑制作用

MTT法檢測(cè)S1～S7對(duì)各細(xì)胞的抑制效果及IC50值見圖4和表6。綜合來看，當(dāng)分別用S1～S7作用于細(xì)胞24 h時(shí)，S1～S7均不同程度的抑制6株供試細(xì)胞的增殖，且具有濃度依賴性(P< 0.05)。其中S2、S5和S6抗腫瘤作用優(yōu)于其余4種。S6對(duì)Hela、SMMC-7721和HepG2 細(xì)胞的增殖抑制效果較強(qiáng)，IC50值分別為0.37、0.43和0.66 mg/mL，對(duì)人正常肝細(xì)胞L02幾乎沒有抑制作用。因S2和S5的溶解效果較差，故本研究后續(xù)試驗(yàn)中均選S6即土荊芥種子石油醚-乙酸乙酯-正丁醇提取物(petroleum ether-ethyl acetate-n-butanol extract ofC.ambrosioidesseeds)進(jìn)行抗腫瘤作用研究。

圖2 槲皮素(A)和山奈酚(B)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of quercetin (A) and kaempferol (B)

圖3 槲皮素和山奈酚含量測(cè)定的高效液相色譜圖Fig.3 High performance liquid chromatogram of determination of quercetin and kaempferol注：S1～S7同表1；A:槲皮素標(biāo)品；B:山奈酚標(biāo)品；C:S2；D:S3；E:S5；F:S6；1:槲皮素；2:山奈酚。Note:S1-S7 are the same as table 1;A:Standard product of quercetin;B:Standard product of kaempferol;C:S2；D:S3；E:S5；F:S6;1:Quercetin;2:Kaempferol.

圖4 S1～S7對(duì)L02、Hela、SMMC-7721、Hep3b、HepG2和HT29細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effects of S1-S7 on proliferation of L02,Hela,SMMC-7721,Hep3b,HepG2 and HT29 cells注：S1～S7同表1；0 mg/mL：1% DMSO對(duì)照；*表示顯著差異(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。Note: S1-S7 are the same as table 1; Control of 1% DMSO; *represents difference P<0.05; **represents highly dominant difference P<0.01.

表5 土荊芥種子提取物中槲皮素及山奈酚含量

表6 S1～S7對(duì)6株細(xì)胞的IC50值(mg/mL)

注：S1～S7同表1；“-”表示無抗腫瘤作用。

Note:S1-S7 are the same as Table 1;“-” means no antitumor effect.

2.4 S6對(duì)SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)變化的影響

溶劑對(duì)照組的SMMC-7721細(xì)胞呈舒展?fàn)钯N壁生長(zhǎng)，有明顯的細(xì)胞分裂相出現(xiàn)(圖5a)；隨著S6處理濃度的增大，SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)、粘附性和折光性均發(fā)生變化，細(xì)胞粘附力下降，逐漸開始皺縮變圓，高劑量組大部分細(xì)胞懸浮死亡(圖5b～d)。表明S6對(duì)SMMC-7721細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒性。

圖5 S6對(duì)SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.5 Effect of S6 on the morphology in SMMC-7721 cells注：a：1% DMSO對(duì)照；b：0.1 mg/mL S6；c：0.3 mg/mL S6；d：0.7 mg/mL S6，下同。Note:a:control of 1% DMSO;b:0.1 mg/mL of S6;c:0.3 mg/mL of S6;d:0.7 mg/mL of S6,the same below.

2.5 S6對(duì)SMMC-7721細(xì)胞集落形成的影響

SMMC-7721細(xì)胞集落形成試驗(yàn)是通過觀察結(jié)晶紫的染色程度來作為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)的，結(jié)果顯示，S6濃度越高，結(jié)晶紫染色越淺，表明SMMC-7721細(xì)胞形成的集落數(shù)越少(圖6)，進(jìn)一步說明S6對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用。

圖6 S6對(duì)SMMC-7721細(xì)胞集落形成試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Clone formation assay of S6 in SMMC-7721 cells

2.6 S6對(duì)SMMC-7721細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的影響

鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果如圖7所示，與溶劑對(duì)照組相比(圖7a)，隨著S6處理濃度的增加，細(xì)胞的熒光強(qiáng)度逐漸減弱(圖7 b、c、d)，且細(xì)胞體積皺縮變小，微絲在細(xì)胞內(nèi)彌散分布，高濃度S6處理組(0.6 mg/mL)中出現(xiàn)排列紊亂的現(xiàn)象。

圖7 S6對(duì)SMMC-7721細(xì)胞骨架的影響Fig.7 Effects of S6 on the cytoskeleton in SMMC-7721 cells

3 討論與結(jié)論

天然產(chǎn)物黃酮類化合物的提取方法主要有索氏提取、有機(jī)溶劑萃取、超聲波提取法、微波萃取法等，提取溶劑常以有機(jī)溶劑為主[13-15]。本研究選擇不同極性有機(jī)溶劑石油醚、乙酸乙酯、正丁醇以及蒸餾水單獨(dú)或依次為溶劑，采用微波超聲波組合合成/萃取儀提取四川產(chǎn)土荊芥種子總黃酮，結(jié)果顯示，經(jīng)正丁醇提取的S3和S6總黃酮提取率明顯較其他溶劑高(3.41%和3.97%)，以石油醚為溶劑提取率最低(0.28%)。表明總黃酮的提取率可能與溶劑極性有關(guān)，黃酮類化合物多以極性稍大的苷元形式存在，一般易溶于強(qiáng)極性溶劑中[16]，根據(jù)相似相溶的原理，溶劑極性越強(qiáng)，總黃酮的提取率可能越高，該結(jié)果與Shen等[17]研究極性越強(qiáng)的溶劑提取加拿大一枝花總黃酮得率越高的結(jié)果基本一致。而S4和S7中總黃酮提取率較低，可能是因許多黃酮類化合難溶或微溶于水[18]。槲皮素和山奈酚是多種植物黃酮的主要成分，且具有明顯的抗腫瘤作用[19-21]，本研究中對(duì)S1～S7中槲皮素、山奈酚的含量測(cè)定顯示，不同溶劑總黃酮提取物中槲皮素和山奈酚的含量不同，S2中槲皮素含量最高，為0.602 mg/g，S6中山奈酚含量最高，為0.479 mg/g，表明較高極性溶劑乙酸乙酯和正丁醇提取的槲皮素和山奈酚含量較高，這與Gu[22]和Wang[23]等測(cè)定不同植物有機(jī)溶劑提取物中槲皮素和山奈酚含量的研究結(jié)果一致。

提取溶劑除對(duì)提取物的成分影響較大，對(duì)其抗腫瘤活性也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的影響。Duan等[24]發(fā)現(xiàn)血人參石油醚部位、醋酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位及乙醇提取物均有一定抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。其中以乙酸乙酯部位的作用最佳。本研究中對(duì)S1～S7抗腫瘤作用評(píng)價(jià)顯示7種提取物的抗腫瘤作用也不盡相同。S6和S4對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的IC50值分別為0.43和11.56 mg/mL，相差27倍，表明不同溶劑對(duì)提取物的抗腫瘤作用影響較大。同一種提取物對(duì)不同細(xì)胞的抑制效果也不盡相同，如S6對(duì)Hela和SMMC-7721細(xì)胞的抑制作用大于HepG2、Hep3b和L02細(xì)胞，但對(duì)HT29未檢測(cè)到抑制作用。

在土荊芥種子總黃酮的提取中，綜合不同溶劑提取物的總黃酮含量、溶解性和抗腫瘤作用，以S6(石油醚-乙酸乙酯-正丁醇)提取方案為最佳選擇。進(jìn)一步以SMMC-7721細(xì)胞為靶標(biāo)研究顯示，S6可導(dǎo)致該細(xì)胞粘附性和折光性下降，逐漸皺縮變圓至懸浮死亡，表明S6對(duì)SMMC-7721細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性，同時(shí)集落形成實(shí)驗(yàn)顯示其具有抑制細(xì)胞集落形成的能力；鬼筆環(huán)肽染色后顯示，經(jīng)S6處理后，細(xì)胞的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，微絲在細(xì)胞內(nèi)彌散分布，排列紊亂，表明S6可能影響細(xì)胞骨架重組，提示S6提取物對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的毒性與細(xì)胞骨架有關(guān)。有關(guān)S6提取物的抗腫瘤作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。