董偉 楊愛(ài)東 李小茜 吳中華 符勝光

摘要：目的? 觀察大黃對(duì)脂多糖致RAW264.7細(xì)胞炎癥模型mTOR/HIF-1α/VEGF信號(hào)通路的影響，探討其作用機(jī)制。方法? 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為正常組、模型組、雷帕霉素組和大黃低、中、高劑量組，MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性后，ELISA檢測(cè)白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-1β和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子-lα （HIF-1α）、p70S6K1和eIF4E mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、HIF-1α、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）蛋白表達(dá)。結(jié)果? 與正常組比較，模型組細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β含量明顯升高（P<0.05，P<0.01），HIF-1α、eIF4E和p70S6K1 mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.05，P<0.01），HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，大黃各劑量組細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-1β含量降低，HIF-1α、p70S6K1和eIF4E mRNA表達(dá)降低，HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)降低。結(jié)論? 大黃可下調(diào)炎癥因子水平，其機(jī)制可能與其下調(diào)HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)及HIF-1α、eIF4E、p70S6K1 mRNA表達(dá)水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞：炎癥;大黃;mTOR/HIF-1α/VEGF信號(hào)通路;細(xì)胞

中圖分類號(hào)：R285.5? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? 文章編號(hào)：1005-5304（2020）02-0038-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201906319

Effects of Rhei Radix et Rhizoma on mTOR/HIF-1α/VEGF Signal Pathway in Cell RAW264.7 Inflammation Model Induced by LPS

DONG Wei， YANG Aidong， LI Xiaoqian， WU Zhonghua， FU Shengguang

School of Basic Medical Sciences， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，

Shanghai 201203， China

Abstract： Objective To observe the effects of Rhei Radix et Rhizoma on mTOR/HIF-1α/VEGF signal pathway in cell RAW264.7 inflammation model induced by LPS. Methods Experimental cells were divided into normal group， model group， rapamycin group and Rhei Radix et Rhizoma low-， medium-， and high-dosage groups. After MTT inspection for cytotoxicity， the levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 were measured by ELISA; Expression of HIF-1α， p70S6K1， eIF4E mRNA were detected by PCR; Expression of mTOR， HIF-1α and VEGF protein detected by Western blot. Results Compared with the normal group， the levels of TNF-α， IL-6 and IL-1β in the model group significantly increased （P<0.05， P<0.01）; the mRNA expressions of HIF-1α， EIF4E and p70S6K1 in the model group significantly increased （P<0.05， P<0.01）; the protein expressions of HIF-1α and VEGF in the model group significantly increased （P<0.05）. Compared with the model group， the levels of TNF-α， IL-6， and IL-1β in Rhei Radix et Rhizoma groups decreased; the mRNA expressions of HIF-1α， p70S6K1 and eIF4E decreased; the protein expression of HIF-1α and VEGF decreased. Conclusion Rhei Radix et Rhizomacan decrease the levels of inflammatory factors， and the mechanism may be related to down-regulating the protein expressions of HIF-1α and VEGF and mRNA expressions of HIF-1α， eIF4E， and p70S6K1.

Keywords： inflammation; Rhei Radix et Rhizoma; mTOR/HIF-1α/VEGF signal pathway; cells

炎癥是由各種炎性細(xì)胞分泌的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子共同介導(dǎo)的綜合防御體系。然而，當(dāng)炎癥過(guò)度或調(diào)控不當(dāng)時(shí)，會(huì)引起各種病理表現(xiàn)，如間質(zhì)性肺炎、纖維素性心包炎等。研究表明，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）與炎癥、損傷、增生、組織修復(fù)、纖維化及腫瘤發(fā)生發(fā)展等一系列重要的病理生理過(guò)程密切相關(guān)。缺氧誘導(dǎo)因子-lα（HIF-1α）在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起重要作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）可被炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-6等誘導(dǎo)和調(diào)控[1]。大黃味苦，性寒，歸脾、胃、大腸、肝、心包經(jīng)，有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)和利濕退黃功效。目前對(duì)大黃調(diào)控炎癥的機(jī)制還未明確，本研究通過(guò)建立LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥模型，探討大黃對(duì)LPS誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥模型mTOR/HIF-1α/VEGF信號(hào)通路的影響，為臨床上大黃治療炎癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1? 實(shí)驗(yàn)材料

1.1? 細(xì)胞及培養(yǎng)

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供。細(xì)胞加入DMEM高糖培養(yǎng)基，置于5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d。當(dāng)細(xì)胞融合80%～90%進(jìn)行傳代。傳代后吸棄DMEM高糖培養(yǎng)基，PBS沖洗2遍，再加入新鮮常溫胎牛血清，輕輕沿一個(gè)方向吹打細(xì)胞，傳代比例為1∶4，實(shí)驗(yàn)用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行。

1.2? 藥物及制備

大黃，購(gòu)于上海同濟(jì)堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)170401。取大黃126 g置于煎藥壺內(nèi)，加藥物體積8倍量水，浸泡30 min，武火煮沸后文火煎煮30 min，過(guò)濾，再加6倍量水繼續(xù)煎煮30 min，過(guò)濾，合并濾液，濃縮至300 mL，將濃縮液分裝在不同的塑料瓶?jī)?nèi)，高度不超過(guò)1 cm，用保鮮膜包裹塑料瓶?jī)蓪?，置?80 ℃冰箱凍存。使用時(shí)將藥液從冰箱取出，放入凍干機(jī)53 h，得凍干粉7.5 g，得粉率6%。雷帕霉素片，APExBIO，批號(hào)A8167。

1.3? 主要試劑與儀器

LPS O55：B5（Sigma，057M4013V），BSA試劑盒（上海碧云天），RPMI1640培養(yǎng)液（日本Gibco），TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒（蘇州卡爾文生物科技有限公司），mTOR抗體、HIF-1α抗體、VEGF抗體（美國(guó)Abcam），Trizol（Invitrogen），RT試劑盒（TAKARA），無(wú)水酒精、甲醇、異丙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。低溫冷凍離心機(jī)3K15（美國(guó)Sigma），酶標(biāo)儀680型（美國(guó)Bio-Rad），SDS-PAGE電泳儀（MINI Protean2，美國(guó)Bio-Rad），BH2顯微鏡（日本Olympus），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（7500fast，美國(guó)ABI）。

1.4? 內(nèi)毒素溶液配制

稱適量LPS粉末于1.5 mL EP管中，加入無(wú)菌PBS溶解配制為10 mg/mL溶液，震蕩，使其充分溶解，分裝，置于-20 ℃冰箱保存。使用時(shí)用無(wú)菌PBS稀釋至1 mg/mL，加入細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至終濃度為1 μg/mL。

2? 實(shí)驗(yàn)方法

2.1? 分組、造模和給藥

實(shí)驗(yàn)分為空白組、模型組、雷帕霉素組和大黃低、中、高劑量組。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105個(gè)/mL，接種至6孔板，每孔2 mL;第2日待細(xì)胞融合80%～90%，分別加入不同劑量大黃凍干粉（200、400、800 μg/mL）、空白培養(yǎng)液及雷帕霉素藥液（30 nmol/L），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔;培養(yǎng)24 h后加入LPS（500 ng/mL），繼續(xù)培養(yǎng)2 h;每孔完全吸棄培養(yǎng)液后，常溫?zé)o菌PBS洗滌細(xì)胞;每孔完全吸棄PBS后加入200～300 μL RIPA裂解液，使雷帕霉素藥液均勻平鋪于孔底，然后置于水平搖床，震蕩10 min，使細(xì)胞與裂解液完全充分接觸;吸取6孔板中每孔細(xì)胞懸液放入EP管，4 ℃、1500 r/min離心10 min，分離細(xì)胞上清液，取新的1.5 mL EP管，吸取細(xì)胞上清液，置于-80 ℃冰箱保存。

2.2? Western blot檢測(cè)雷帕霉素靶蛋白、缺氧誘導(dǎo)因子-lα、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá)

用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，加入相應(yīng)上樣緩沖液及RIPA裂解液，水浴鍋100 ℃，10 min完成蛋白變性。配制6%分離膠，5%濃縮膠，細(xì)胞每孔上樣量10 μL，經(jīng)SDS-PAGE垂直凝膠設(shè)置80 V、120 min進(jìn)行電泳，通過(guò)恒流350 mA、200 min轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。采用QuickBlock? Western封閉液，將膜放置于水平搖床上室溫封閉約10 min后，將膜按分子量位置剪成4段后，分別加用一抗稀釋液稀釋后的mTOR（289 kD）、VEGF（210 kD）、HIF-1α（120 kD）及β-actin（42 kD）內(nèi)參抗體，4 ℃搖床孵育過(guò)夜。次日洗膜，TBST沖洗3次×10 min，再加相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，TBST沖洗3次×10 min，ECL試劑曝光顯影。結(jié)果用靶蛋白/內(nèi)參蛋白灰度比值表示。

2.3? ELISA檢測(cè)腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β和白細(xì)胞介素-6含量

收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，1500 r/min離心10 min，取上清液，ELISA測(cè)定TNF-α、IL-1β和IL-6含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.4? PCR檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子-lα、p70S6K1和eIF4E mRNA表達(dá)

吸棄培養(yǎng)液，PBS沖洗1次，采用Trizol法提取RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，10 μL Sybr green+2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物+1 μL上游引物+1 μL下游引物+水ddH2O，共20 μL，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán)（95 ℃、5 s，60 ℃、34 s），引物序列見(jiàn)表1。

3? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以—x±s表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較用ANOVA法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4? 結(jié)果

4.1? MTT細(xì)胞毒性結(jié)果

大黃濃度1600 μg/mL細(xì)胞抑制率為22.27%，大黃濃度800 μg/mL細(xì)胞抑制率幾乎為0%，大黃濃度與細(xì)胞抑制率呈正相關(guān)，至大黃濃度200 μg/mL，細(xì)胞抑制率基本保持穩(wěn)定，故選取大黃濃度200、400、800 μg/mL為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)濃度。

4.2? 大黃對(duì)細(xì)胞模型腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β和白細(xì)胞介素-6含量的影響

與正常組比較，模型組細(xì)胞TNF-α、IL-6 和IL-1β含量明顯升高（P<0.05，P<0.01）;與模型組比較，雷帕霉素組細(xì)胞TNF-α、IL-1β含量明顯降低（P<0.05，P<0.01），大黃低劑量組細(xì)胞TNF-α含量明顯降低（P<0.05），大黃高劑量組細(xì)胞IL-6、IL-1β含量明顯降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。

4.3? 大黃對(duì)細(xì)胞模型缺氧誘導(dǎo)因子-lα、p70S6K1和eIF4E mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組細(xì)胞HIF-1α、eIF4E、P70S6K1 mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.05，P<0.01）;與模型組比較，雷帕霉素組細(xì)胞p70S6K1 mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.01）;大黃各劑量組細(xì)胞HIF-1α、p70S6K1、eIF4E mRNA表達(dá)降低，除大黃中劑量組eIF4E mRNA表達(dá)外，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表3。

4.4? 大黃對(duì)細(xì)胞模型雷帕霉素靶蛋白、缺氧誘導(dǎo)因子-lα、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組細(xì)胞HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，大黃各劑量組細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05，P<0.01），大黃中劑量組細(xì)胞mTOR蛋白表達(dá)均明顯降低（P<0.05），大黃高劑量組細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

5? 討論

炎癥及炎癥反應(yīng)廣泛存在于心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)疾病中。正常炎癥反應(yīng)有助于機(jī)體清除致病因素、壞死組織及受損細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體再生修復(fù)能力，減輕各種炎癥因子和介質(zhì)的合成與釋放、控制炎癥范圍、阻礙炎癥損傷的進(jìn)一步發(fā)展，但過(guò)度的炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體有害，可能導(dǎo)致機(jī)體的二次或更嚴(yán)重的病理反應(yīng)，嚴(yán)重者可產(chǎn)生“瀑布樣反應(yīng)”，最終形成多器官功能障礙綜合征[2-4]，從而導(dǎo)致死亡。

根據(jù)炎癥具體臨床表現(xiàn)如紅、腫、熱、痛和其他反應(yīng)等，可將其歸屬于中醫(yī)學(xué)“熱證”“陽(yáng)證”“火證”等范疇?！端貑?wèn)·至真要大論篇》“盛者瀉之”“留者攻之”。《素問(wèn)·陰陽(yáng)應(yīng)象大論篇》“中滿者，瀉之于內(nèi)”“其實(shí)者，散而瀉之”。疾病的發(fā)生主要取決于人體生理功能完整及全身氣血正常運(yùn)行，無(wú)論外感還是內(nèi)傷，病邪侵襲人體各臟腑組織經(jīng)絡(luò)時(shí)會(huì)導(dǎo)致人體氣機(jī)紊亂，產(chǎn)生有形實(shí)邪或無(wú)形邪氣積聚不去，如火、熱毒、痰、瘀等諸邪，“六腑以通為順”，通過(guò)下法可清除這些積滯在人體中的病邪，以使全身氣血運(yùn)行通暢，進(jìn)而促進(jìn)人體各生理活動(dòng)正常進(jìn)行。

大黃具有瀉熱毒、破積滯、行瘀血功效?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》云其具有“下瘀血，血閉寒熱，破癥瘕積聚，留飲宿食，蕩滌腸胃，推陳致新，通利水谷，調(diào)中化食，安和五臟”之功效。《名醫(yī)別錄》認(rèn)為其能“平胃、下氣，除痰實(shí)，腸間結(jié)熱，心腹脹滿”。

mTOR可整合營(yíng)養(yǎng)、能量及生長(zhǎng)因子等多種細(xì)胞外信號(hào)，與人體炎癥、損傷、增生、組織修復(fù)、纖維化及腫瘤發(fā)生發(fā)展等一系列重要的病理生理過(guò)程密切相關(guān)。mTOR主要通過(guò)p70S6K及4E-BP1來(lái)調(diào)節(jié)下游蛋白質(zhì)翻譯[5]。當(dāng)mTOR磷酸化4E-BP1后，可使其激活。4E-BP1磷酸化可破壞這種結(jié)合，從而釋放出eIF4E，并使其磷酸化后激活相關(guān)蛋白的翻譯[6-7]，其中包括HIF-1α的蛋白翻譯[8]。

HIF-1α是哺乳動(dòng)物機(jī)體在缺氧條件下非常重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。HIF-1α被認(rèn)為在LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起重要作用。研究表明，核因子-κB可通過(guò)HIF-1α依賴性與非依賴性的方式促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子[9-10]。限制巨噬細(xì)胞HIF-1α介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能有益于減輕炎癥相關(guān)的組織損傷。大量研究表明，炎癥時(shí)HIF-1α被激活，其下游許多經(jīng)典靶基因如VEGF的表達(dá)被上調(diào)[11]，尤其是HIF-1α可促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生，如TNF-α、IL-6等。敲除巨噬細(xì)胞中HIF-1α能明顯減輕LPS導(dǎo)致的敗血癥與動(dòng)物的死亡率，降低炎癥因子的產(chǎn)生，進(jìn)一步證明LPS對(duì)HIF-1α的誘導(dǎo)作用，提示HIF-1α在炎癥反應(yīng)中的潛在作用[12]。VEGF是強(qiáng)大的血管通透因子，也是組織生長(zhǎng)和修復(fù)所必需的。研究表明，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)對(duì)VEGF也有調(diào)控作用，IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子能誘導(dǎo)VEGF合成。

本研究針對(duì)不同大黃濃度MTT細(xì)胞毒性測(cè)試結(jié)果表明，大黃濃度越低，細(xì)胞抑制率越低，直到大黃濃度為200 μg/mL時(shí)細(xì)胞抑制率保持穩(wěn)定。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組比較，模型組細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-1β含量明顯升高，說(shuō)明成功建立LPS致RAW264.7細(xì)胞炎癥模型。與模型組比較，大黃各劑量組細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β含量顯降低，且HIF-1α、p70S6K1和eIF4E mRNA表達(dá)顯著降低，HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)明顯降低。綜上，大黃下調(diào)內(nèi)毒素誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞模型炎癥因子的機(jī)制可能與其下調(diào)HIF-1α、VEGF蛋白及HIF-1α、eIF4E、p70S6K1 mRNA表達(dá)有關(guān)。

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（收稿日期：2019-06-21）

（修回日期：2019-08-09;編輯：華強(qiáng)）

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFC1704102）;國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81673855）;上海市進(jìn)一步加快中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展三年行動(dòng)計(jì)劃[ZY（2018-2020）-CCCX-2001-01];上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床基礎(chǔ)學(xué)科（A1-Z193020109）

通訊作者：楊愛(ài)東，E-mail：aidongy@126.com