梁天一，楊娟，董浩，于立梅，韓冰，曾曉房*

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，哈爾濱 150028；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院，廣州 510225)

一種基于氣相色譜(gas chromatography，GC)和離子遷移譜(ion mobility spectrometry，IMS)的聯(lián)用技術(shù)逐漸應(yīng)用于食品研究，該項(xiàng)技術(shù)通過整合二者在分離和檢測(cè)方面的優(yōu)勢(shì)，形成具有高分辨率、高靈敏度、分析高效、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)的氣體快檢技術(shù)[1]。近年來(lái)，離子遷移光譜法已成為最成功和最廣泛使用的技術(shù)，用于檢測(cè)手提袋上的痕量硝基有機(jī)炸藥[2]。離子遷移譜中的基本問題一般對(duì)分析應(yīng)用具有實(shí)際意義，特別是在三個(gè)方面具有組學(xué)意義。了解離子遷移率和碰撞截面值如何取決于碰撞氣體，電場(chǎng)和溫度對(duì)于確定它們?cè)趦x器平臺(tái)上的可轉(zhuǎn)移性至關(guān)重要。為了在工作流程中充分發(fā)揮離子遷移的潛力，必須預(yù)測(cè)新分析物的碰撞截面值。最后，理解氣相中離子結(jié)構(gòu)的命運(yùn)對(duì)于推斷基于氣相離子遷移率測(cè)量的溶液結(jié)構(gòu)的有意義信息是必不可少的[3]。目前最新研究中，離子遷移率-質(zhì)譜和低溫紅外光譜在單個(gè)儀器中組合，從而可以獲得由m/z、碰撞截面和IR指紋組成的數(shù)據(jù)集[4]。隨著儀器的進(jìn)步、對(duì)IMS測(cè)量原理的理解以及發(fā)展、導(dǎo)致近年來(lái)其在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用增加。

陳皮是蕓香科植物橘類或者由橘類變性栽種植物果皮干制而成的，是一種具有理氣和中、化痰止咳功效，適用于胸腹脹痛和嘔吐噦逆等病癥的中藥材[5]。但因其培育品種的不同，新會(huì)陳皮最為著名、昂貴。隨著陳化時(shí)間的增加，其品質(zhì)和收藏價(jià)值也越高。這與其隨著陳化時(shí)間的增加而形成的特征性風(fēng)味物質(zhì)有很大關(guān)系。雖然裴亞萍[6]、陳榮榮[7]都通過GC-MS分析了不同陳化年份陳皮揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。但是國(guó)內(nèi)應(yīng)用GC-IMS技術(shù)分析不同陳化年份陳皮的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究卻很少、GC-IMS 分析具有操作時(shí)間短、樣品用量少、操作快速、分離能力高、鑒定準(zhǔn)確度高[8]，結(jié)果受主觀因素影響小?？尚哦群椭貜?fù)性高的優(yōu)點(diǎn)[9]。并綜合了色譜法的分離能力和質(zhì)譜的定性長(zhǎng)處，可在較短時(shí)間內(nèi)完成多組分混合物的定性和定量分析[10]，與電子鼻相反，可以檢測(cè)單一物質(zhì)含量。所以，本研究通過GC-IMS技術(shù)研究不同陳化年份對(duì)陳皮風(fēng)味物質(zhì)形成的影響有一定的科研價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新會(huì)陳皮：廣東省江門麗宮國(guó)際食品股份有限公司。樣品處理：每個(gè)樣品做兩個(gè)平行，每個(gè)平行樣分別取0.5 g(精確到0.01 g)，直接置于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，75 ℃孵育20 min后進(jìn)樣。

1.2 儀器與設(shè)備

Flavour Spec 1H1-00053 型氣相離子遷移譜 德國(guó) G.A.S.公司；CTC-PAL 自動(dòng)進(jìn)樣裝置 瑞士CTC Analytics AG公司；CLOT毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.50 μm) 德國(guó) CS Chromatographic Service GmbH 公司。

1.3 試驗(yàn)條件

1.3.1 頂空進(jìn)樣條件

頂空孵化溫度：75 ℃；孵化時(shí)間：20 min；進(jìn)樣體積：500 μL，不分流模式；進(jìn)樣針溫度：85 ℃；載氣：高純 N2(純度≥99.999%)， 孵化轉(zhuǎn)速：500 r/min。

1.3.2 氣相色譜條件

色譜柱類型：FS-SE-54-CB-1；色譜柱溫：75 ℃；運(yùn)行時(shí)間：40 min；載氣：高純 N2(純度≥99.999%)；載氣流速：起始流速2 mL/min，2～15 min 線性上升至 15 mL/min，15～25 min 線性上升至100 mL/min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

儀器配套的分析軟件包括LAV(Laboratory Analytical Viewer)和 Dynamic PCA插件、Gallery Plot插件、Reporter插件以及GC×IMS Library Search，可以分別從不同角度進(jìn)行樣品分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 12年陳皮樣品中的風(fēng)味物質(zhì)定性分析

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量與風(fēng)味特征之間無(wú)直接關(guān)系，其對(duì)總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)是由揮發(fā)性組分在風(fēng)味體系中的濃度和感覺閾值共同決定的[11]。對(duì)12年陳皮的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性分析，其風(fēng)味物質(zhì)的分布情況見圖1。

圖1 GC-IMS定性分析Fig.1 Qualitative analysis of GC-IMS

其主要的風(fēng)味物質(zhì)有乙醇(Ethanol)、丙酮(Acetone)、己醛(Hexanal)、糠醛(Furfurol)、順-2-己烯-1-醇(cis-hex-2-en-1-ol)、正己醇(n-Hexanol)、環(huán)己酮(Cyclohexanone)、庚醛(Heptanal)、α-蒎烯(α-Pinene)、苯甲醛(Benzaldehyde)、辛醛(Octanal)、芳樟醇(Linalool)、正壬醛(n-Nonanal)、吡喃(Pyran)、苯乙酮(Acetophenone)、癸醛(Decanal)、反式-2-十一烯醛(trans-2-Undecenal)、正丁醇(n-Butanol)、雙戊烯(Limonene)、戊醇(Pentanol)、松油醇(Terpineol)、戊醛(Pentanal)、β-蒎烯(β-Pinene)、2-庚酮(2-Heptanone)為陳皮的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

表1 GC-IMS定性分析主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 1 Qualitative analysis of main volatile flavor substances by GC-IMS

續(xù) 表

由表1可知，反式-2-十一烯醛、癸醛、松油醇等是保留時(shí)間較長(zhǎng)的一種風(fēng)味物質(zhì)，乙醇、丙酮等是遷移時(shí)間比較短的風(fēng)味物質(zhì)。

2.2 直接對(duì)比不同年份的陳皮樣品中的風(fēng)味差異

圖2 直接對(duì)比不同年份的陳皮樣品中的風(fēng)味差異Fig.2 Directly comparison of the flavor differences in tangerine peel samples with different years

由圖2可知，從不同年份陳皮的GC-IMS圖譜中得知，縱坐標(biāo)代表氣相色譜的保留時(shí)間，橫坐標(biāo)代表離子遷移時(shí)間。橫坐標(biāo)1.0處豎線為RIP峰(反應(yīng)離子峰，經(jīng)歸一化處理)，RIP峰兩側(cè)的每一個(gè)點(diǎn)代表一種揮發(fā)性有機(jī)物，顏色越深表示濃度越大。

由圖3可知，為了更加明顯比較不同年份陳皮樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的差異，選取7年陳皮樣品的譜圖(C-2)作為參比，其他樣品的譜圖扣減參比。如果二者揮發(fā)性有機(jī)物一致，則扣減后的背景為白色，而黑色代表該物質(zhì)的濃度高于參比，藍(lán)色代表該物質(zhì)的濃度低于參比，整個(gè)譜圖代表了樣品的全部頂空成分。

由圖4可知，陳皮揮發(fā)性組分可以通過GC-IMS技術(shù)很好的分離，且可直觀看出樣品間的差異[12]。其中12年陳皮的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)明顯與其他3個(gè)年份不同，紅色部分較多，藍(lán)色部分較少。說(shuō)明12年陳皮中的大部分揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量明顯高于其他3個(gè)年份，少部分的風(fēng)味物質(zhì)含量較低；1年陳皮中的萜烯類風(fēng)味物質(zhì)的含量明顯較低，其他一些物質(zhì)的含量則比較高；3年陳皮中的風(fēng)味物質(zhì)與7年陳皮中的較為相似，在圖4中看不出明顯差別。

圖3 以C-2做參比的二維圖譜Fig.3 Two-dimensional graph with C-2 as a reference

注：因黑白印刷原因，無(wú)法辨別顏色，如有需要可向編輯部聯(lián)系索取，下同。

圖4 不同年份的陳皮樣品中的風(fēng)味物質(zhì)三維譜圖Fig.4 Three-dimensional graph of flavor substances in tangerine peel samples with different years

2.3 不同年份陳皮樣品風(fēng)味物質(zhì)指紋圖譜對(duì)比

由圖5可知，不同陳化時(shí)間揮發(fā)性組分可通過 GC-IMS 技術(shù)很好地分離，且可直觀看出不同陳化時(shí)間的揮發(fā)性物質(zhì)差異，根據(jù)揮發(fā)性物質(zhì)氣相色譜保留時(shí)間和離子遷移時(shí)間對(duì)揮發(fā)性組分進(jìn)行定性分析。陳皮在陳化過程中，共計(jì)檢測(cè)出 53種揮發(fā)性物質(zhì)，通過內(nèi)置數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行二維定性，確定了24種具體揮發(fā)性物質(zhì)組成。為了更好地比較樣品之間風(fēng)味物質(zhì)的變化情況，框選這些風(fēng)味物質(zhì)的峰，形成樣品指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比[13]。

圖5中每一行代表一個(gè)陳皮樣品中選取的全部信號(hào)峰，每一列代表同一風(fēng)味物質(zhì)在不同年份的陳皮樣品中的信號(hào)峰。由圖5可知每種樣品的完整揮發(fā)物信息以及樣品之間風(fēng)味物質(zhì)的差異。整個(gè)指紋譜圖中，從上到下依次是1年陳皮-1、1年陳皮-2、3年陳皮-1、3年陳皮-2、7年陳皮-1、7年陳皮-2、12年陳皮-1、12年陳皮-2樣品，其中1年陳皮和12年陳皮中的風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)于3年陳皮和7年陳皮樣品中的風(fēng)味物質(zhì)較為特別。由于上圖太小，而且峰太多不好分析，因此選取在這幾種樣品中存在明顯差異的揮發(fā)性有機(jī)物進(jìn)行進(jìn)一步分析。

由圖6可知，紅色框中A樣品的風(fēng)味物質(zhì)分別是這4個(gè)陳皮樣品相對(duì)于其他3個(gè)樣品中含量較高的物質(zhì)；隨著陳化年份的升高，樣品紅色框中的風(fēng)味物質(zhì)越來(lái)越少。紅色框區(qū)域1中的物質(zhì)，如：左旋玫瑰醚(cis-Rose oxide)、2-庚酮(2-Heptanone)、己醛(Hexanal)、苯甲醛(Benzaldehyde)、環(huán)己酮(Cyclohexanone)、戊醛(Pentanal)、正戊醇(n-Pentanol)等在1年陳皮中的含量比其他3個(gè)年份的高。紅色框區(qū)域2中的物質(zhì),如：1-己醇(1-Hexanol)、2-己醇(2-Hexanol)、辛醛(Octanal)、2-十一碳烯醛(2-Undecenal)、苯乙酮(Acetophenone)、2-丙醇(2-Propanol)等物質(zhì)在12年陳皮樣品中含量相對(duì)比較高，在其他3個(gè)陳皮樣品中含量則相對(duì)較低。紅色框區(qū)域3中的物質(zhì)庚醛(Heptanal)等物質(zhì)在7年陳皮中含量相對(duì)較高，在其他3個(gè)陳皮樣品中含量較低。

由圖7可知，綠色框中的物質(zhì)，如：α-蒎烯(α-Pinene)、檸檬烯(Limonene)、β-蒎烯(β-Pinene)、乙醇(Ethanol)等物質(zhì)則是在3年、7年、12年陳皮樣品中含量較高，而1年陳皮中這些萜烯類物質(zhì)的含量相對(duì)較少；并隨著年份的升高而升高。

黃色色框中的物質(zhì)，如：松油醇(α-Terpineol)、癸醛(Decanal)、丙酮(Acetone)、芳樟醇(Linalool)等物質(zhì)在3年、7年、12年陳皮樣品中含量較高，而1年陳皮中則很少有這些風(fēng)味物質(zhì)；且12年陳皮中的松油醇(Terpineol)和芳樟醇(Linalool)的含量要比3年和7年陳皮中的高一些；其他物質(zhì)，如：糠醛(Furfurol)、環(huán)己酮(Cyclohexanone)、庚醛(Heptanal)、1-丁醇(1-Butanol)、己醛(Hexanal)、2-己醇(2-Hexanol)等物質(zhì)則是在這4個(gè)陳皮樣品中都存在一些，只是在含量上有差異。其中醇類物質(zhì)、醛類物質(zhì)、烯烴類物質(zhì)對(duì)陳化年份的揮發(fā)性有機(jī)物影響比較大。烴類化合物分子量大且閾值高，香氣不突出。烯烴中的萜類化合物閾值不高[14]。酚類是微生物通過復(fù)雜的作用機(jī)理，通過自然發(fā)酵方式形成的化合物，檢測(cè)結(jié)果顯示陳皮中含量很少[15]。酯類是主要的香氣貢獻(xiàn)物，大多具有花香或者果香，在檢測(cè)結(jié)果中并沒有體現(xiàn)[16]。陳皮最主要的風(fēng)味物質(zhì)還是醇、酮、醛三類。

圖5 不同年份陳皮的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的指紋圖譜Fig.5 Fingerprint spectra of volatile flavor substances in tangerine peels with different years

圖6 局部指紋圖Fig.6 Local fingerprint spectra

圖7 局部指紋圖Fig.7 Local fingerprint spectra

2.4 不同年份的陳皮樣品的聚類分析

主成分分析是非監(jiān)督類模式識(shí)別中的一種重要的分類方法，它是通過降維技術(shù)，根據(jù)貢獻(xiàn)率的大小，用少數(shù)幾個(gè)具有代表性的綜合指標(biāo)代替多個(gè)原始變量的多元統(tǒng)計(jì)分析方法，如今該方法已廣泛應(yīng)用于中藥指紋圖譜研究[17]。根據(jù)GC-IMS的二維和三維數(shù)據(jù)圖形化表達(dá)對(duì)陳化時(shí)間研究仍受到觀測(cè)者主觀認(rèn)知的影響。通過對(duì)以VOCs種類為變量的高維數(shù)組進(jìn)行維度壓縮，去除冗余信息和空間噪聲，用少量線性無(wú)關(guān)的綜合變量替代原有變量，并投影至較低維度的平面上，可便于對(duì)不同陳化時(shí)間的陳皮進(jìn)行特征差異的可視化分析[18]。主成分分析法被許多研究者作為主要的分析工具，目的是簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)和揭示變量間的關(guān)系[19]。

圖8 主成分分析Fig.8 Principal component analysis

由圖8可知，選取所有峰進(jìn)行PCA分析，其中：紅色圓點(diǎn)為1年陳皮樣品，綠色圓點(diǎn)為3年陳皮樣品，藍(lán)色圓點(diǎn)為7年陳皮樣品，黃色圓點(diǎn)為12年陳皮樣品。

由圖8可知，1年和12年的陳皮區(qū)分非常明顯，說(shuō)明這兩個(gè)樣品的風(fēng)味比較獨(dú)特，這與指紋譜圖中的樣品信號(hào)峰信息基本一致；而3年樣品和7年樣品聚類較為相近，說(shuō)明這兩個(gè)樣品的風(fēng)味比較相似。

3 結(jié)論

采用氣相色譜-離子遷移譜聯(lián)用系統(tǒng)，建立了不同年份的陳皮樣品風(fēng)味物質(zhì)的分析測(cè)試方法，并對(duì)所得的指紋圖譜進(jìn)行了比較，得出結(jié)論：1年陳皮樣品和12年陳皮樣品中的風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)于3年和7年陳皮樣品中的風(fēng)味物質(zhì)較為特別；而3年和7年樣品中的風(fēng)味物質(zhì)較為相似；且1年陳皮樣品中的萜烯類物質(zhì)的含量相對(duì)較少，沒有其他3個(gè)陳皮樣品中的多，其中的左旋玫瑰醚、2-庚酮、己醛含量較其他3種陳皮高。而12年陳皮的特征性風(fēng)味物質(zhì)松油醇和芳樟醇明顯高于其他3個(gè)年份。采用 PCA可視化的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理，選取所有的信號(hào)峰，根據(jù)不同陳化年份的陳皮揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的指紋圖譜，更直觀形象地呈現(xiàn)了不同陳化年份陳皮揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的區(qū)分情況。其中1年和12年陳皮的差異較大，3年和7年的陳皮聚類相似。通過分析不同陳化年份陳皮的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)可對(duì)陳皮的選材提供科學(xué)數(shù)據(jù)，為下一步的研究提供數(shù)據(jù)支撐。還可以進(jìn)一步對(duì)不同產(chǎn)地的陳皮做風(fēng)味物質(zhì)研究，對(duì)未來(lái)陳皮的風(fēng)味研究提供參考依據(jù)。