王延輝，周文斯，何艷麗，沈詩珺

(1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W校 食品學院，浙江 寧波 315000；2.華南理工大學 食品科學與工程學院，廣州 510640)

醬油是一種世界流行的色、香、味俱全的液體調味品，尤其是在中國、日本、韓國等東亞國家。它主要是以大豆(豆粕)或小麥等為主要原料，添加米曲霉固態(tài)制曲和液態(tài)醬醪發(fā)酵制備而成。在大曲發(fā)酵過程中，各種微生物(如米曲酶等)的生理代謝和豐富酶系的生化作用將原料中的蛋白質、淀粉等大分子物質消化分解成小分子肽、游離氨基酸、糖類等小分子物質，賦予了釀造醬油濃郁持久的香氣和豐富飽滿的醇厚滋味[1,2]。醬醪發(fā)酵過程中，大豆或小麥蛋白可被蛋白酶水解成小肽或游離氨基酸，釋放出來的谷氨酰胺可以進一步水解脫氨生成谷氨酸，因此獲取優(yōu)質鮮味發(fā)酵醬油的關鍵之一是提高大曲的蛋白酶和谷氨酰胺酶活力[3]。醬醪發(fā)酵溫度是影響優(yōu)質醬油生產的重要因素之一。Wu等[4]發(fā)現發(fā)酵溫度對醬油的老化和品質有顯著影響，將醬醪發(fā)酵溫度提高到45 ℃會加速老化并降低醬油中乙醇的含量。Hoang等[5]的優(yōu)化實驗表明醬醪在溫度40.7 ℃、鹽水用量10%(W/W)的條件下發(fā)酵4.6 d，此時醬油中氨基酸態(tài)氮的含量較高。Su等[6]研究了溫度和氯化鈉濃度對醬油蛋白水解酶和淀粉酶活性的影響，發(fā)現45 ℃發(fā)酵可作為一種快速發(fā)酵方法，可以縮短醬油的生產時間，而5%氯化鈉與45 ℃發(fā)酵組合是制備醬油的最佳預水解條件。然而目前很少有報道研究低溫脅迫發(fā)酵工藝對醬油釀造過程中滋味物質形成的影響。

本文旨在全面監(jiān)測發(fā)酵醬油在初期低溫脅迫發(fā)酵工藝下的各種理化指標動態(tài)變化，通過分析醬醪釀造過程中的pH值、谷氨酰胺酶活、中性蛋白酶活變化，結合總氮、氨基酸態(tài)氮、總糖、總酸含量以及滋味感官分析，系統研究不同醬醪發(fā)酵工藝的醬油在釀造過程中滋味物質的釋放規(guī)律，探究低溫脅迫發(fā)酵工藝改善醬油品質的內在機理，從而為調味品行業(yè)以及提高醬油品質等方面提供理論依據和方法指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

米曲霉曲精(Aspergillusoryzae)：山東市濟寧玉園生物科技有限公司；低溫食用豆粕：山東市禹王實業(yè)(集團)有限公司；原料面粉、食鹽等：均為市購。

1.2 試驗試劑

濃硫酸、檸檬酸(一水)、三氯乙酸、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、氯化鉀、甲醛及苯酚：均為分析純；谷氨酰胺、酪蛋白及福林酚試劑：均為生化試劑；碘化丙啶、氨基酸標準品：均為色譜純，購于美國Sigma公司。

1.3 試驗主要儀器設備

HYP-308消化爐、KDN-103F自動定氮儀 上海纖檢儀器有限公司；Bante 321-NH4銨離子選擇電極 上海般特儀器有限公司；PHS-3E數顯pH計 上海精密科學儀器有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 江陰市保利科研器械有限公司；ME204E 分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；TS100 微型旋渦混合儀 杭州瑞誠儀器有限公司；DHG-9070A鼓風干燥箱 上海慧泰儀器制造有限公司；GL21M高速冷凍離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；ZXJP-A1430 霉菌培養(yǎng)箱 上海智誠分析儀器制造有限公司；TIM840自動電位滴定儀 雷迪美特公司；A300 全自動氨基酸分析儀 德國曼默博爾公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 主要工藝流程

按GB 18186-2000《釀造醬油》的方法進行發(fā)酵，以1∶0.5(豆粕干重∶水重)充分潤濕豆粕1 h后在121 ℃的高壓蒸汽滅菌鍋內蒸煮15 min并冷卻。隨后將面粉(豆粕干重的25‰)與米曲霉曲精(豆粕干重的0.3‰)混合拌曲，保溫培養(yǎng)下定時翻曲并于44 h后出曲。成曲按照大曲重∶水重(1∶2.5)與22%(W/W)的鹽混合均勻后，得到鹽水濃度為16%的醬醪。一部分醬醪先在4 ℃冰箱中進行發(fā)酵初期(9 d)的低溫脅迫發(fā)酵，然后放在25 ℃的恒溫發(fā)酵箱中進行保溫發(fā)酵(簡稱為LT組)；另一部分為對照組，始終保持25 ℃恒溫發(fā)酵(簡稱為Control組)。醬醪發(fā)酵總周期為60 d，定時間隔取樣，以8000 r/min冷凍離心20 min 后過濾得到醬醪樣的上清液并于4 ℃低溫貯存待測[7,8]。

1.4.2 pH值的測定

用pH計直接監(jiān)測醬醪釀造初期pH值的變化。

1.4.3 谷氨酰胺酶活力和蛋白酶活力的測定

參考崔春等和Nannipieri等的方法，采用離子選擇電極法測定谷氨酰胺酶活力。參照商業(yè)行業(yè)標準SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》，采用福林酚法測定蛋白酶活力[9,10]。

1.4.4 總氮的測定

參照國標GB 18186—2000《釀造醬油》，采用凱氏定氮法測定樣品中的總氮含量。

1.4.5 氨基酸態(tài)氮的測定

參照國標GB 18186—2000《釀造醬油》，采用甲醛滴定法測定氨基酸態(tài)氮含量。

1.4.6 總酸的測定

參照國標GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》，采用中和滴定法測定總酸含量。

1.4.7 總糖的測定

參照國標GB/T 15672—2009《食用菌中總糖含量的測定》，采用苯酚硫酸法測定總糖含量。

1.4.8 游離氨基酸含量的測定

參照國標GB 5009.124—2016 《食品中氨基酸的測定》測定醬醪樣品中的游離氨基酸含量。用磺基水楊酸法處理待測樣品1 h，以10000 r/min 離心15 min后過濾并用微濾膜(0.22 μm)處理。使用液相離子交換柱(TS263，MembraPure，流速60 μL/min)分離氨基酸后用茚三酮顯色，除脯氨酸檢測波長在440 nm外，其余氨基酸均在570 nm處檢測，采用外標法計算氨基酸濃度[11,12]。

1.4.9 感官評價分析

采用定量描述分析(QDA)法[13,14]。品評小組包括7名男性和5名女性(年齡25～45歲)，測評前對每位感官分析人員進行培訓以提高測評結果的可靠性。感官測評的標準溶液共5種：甜味(蔗糖，1%)、咸味(氯化鈉，0.7%)、鮮味(谷氨酸鈉，0.35%)、苦味(L-異亮氨酸，0.5%)和酸味(檸檬酸，0.08%)。感官評價的結果采用九點線性標度法，0～9分(依次為無感覺、閾值感覺、感覺微弱、感覺中等、感覺強烈)，測評結果用雷達圖進行表征。

1.5 數據分析

試驗結果以兩組發(fā)酵樣的平均數±標準差來表示，每次試驗3次平行，使用SPSS 16.0、OriginPro 9.0和Excel 2016軟件分析所得試驗數據并繪制圖表。

2 結果與討論

2.1 醬醪釀造初期pH值的變化

醬醪釀造過程中的pH值變化會影響醬醪體系的整體酶活力，進而影響醬油成品的品質[15]。醬醪釀造初期pH值的變化見圖1。

圖1 不同釀造工藝下醬醪釀造初期pH值的變化Fig.1 Changes of pH values of soy sauce mash under different brewing process at the early stage

pH呈現出不斷下降的變化趨勢，但不同釀造工藝下醬醪樣品pH的下降速率存在著明顯的差異。發(fā)酵的1～4 d，pH值下降速度較為緩慢，pH值大小始終保持LT組>Control組，且差異顯著。隨著發(fā)酵時間延長，發(fā)酵的5～9 d，pH的下降速度加快，pH值大小仍保持LT組>Control組，但兩者差異進一步拉大。到發(fā)酵的第9天，LT組的pH值降至6.40，而Control組的pH值降至5.90。

醬醪發(fā)酵初期pH值下降的主要原因是微生物的生長代謝及其酶系的復雜生化反應。在低溫脅迫發(fā)酵工藝下，醬醪的pH值始終高于傳統工藝發(fā)酵醬醪的pH值。中性或弱酸性的酶系(如谷氨酰胺酶、中性蛋白酶等)可以更充分地發(fā)揮作用，對原料中的蛋白質進行分解，從而提高氨基酸、總氮和氨氮的生成率。

2.2 醬醪釀造初期谷氨酰胺酶活力和蛋白酶活力的變化

谷氨酰胺酶及蛋白酶是醬油釀造過程中的關鍵酶。谷氨酰胺酶可以酶解L-谷氨酰胺生成鮮味氨基酸(L-谷氨酸)，蛋白酶可以將原料中的蛋白質分解成小分子的肽類，而小分子肽類可進一步被豐富的微生物酶系(如酸性蛋白酶等)分解成氨基酸以達到增鮮、改善風味的效果[16-18]。因此，谷氨酰胺酶活力和中性蛋白酶活力是衡量醬油成品品質的重要指標之一。

圖2 不同釀造工藝下醬醪釀造初期谷氨酰胺酶活力和蛋白酶活力的變化Fig.2 Changes of glutaminase activity and protease activity of soy sauce mash under different brewing process at the early stage

由圖2(a)可知，兩組醬醪樣品的谷氨酰胺酶活力均隨著發(fā)酵時間的延長先急速下降后緩慢下降，LT組>Control組且兩者差異顯著(P<0.05)。發(fā)酵1～5 d，兩組的谷氨酰胺酶活力均迅速下降，但低溫脅迫組(LT組)的酶活力明顯高于對照組(Control組)，且降幅更大。5 d后，兩組的酶活力下降幅度變緩且差值減小。低溫脅迫發(fā)酵下的醬醪pH下降比較慢，這有利于保持酶的活力，延緩酶活力下降的速率。此外，低溫脅迫發(fā)酵下容易出現菌絲體自溶的現象，從而破壞菌體細胞使殘存在菌體內的谷氨酰胺酶釋放出來并發(fā)揮其作用[19,20]。

由圖2(b)可知，由于兩組樣品源于相同的成曲，因此0 d的中性蛋白酶酶活力一致，均為1349.5 U/g。不同醬醪發(fā)酵工藝下醬醪發(fā)酵初期的中性蛋白酶均呈現急速下降后緩慢下降的趨勢，且兩者的降幅差異較小。從第2天起，中性蛋白酶就開始緩慢下降，在第9天時，LT組蛋白酶活力為564.3 U/g，約為初始的1/2～1/3。LT組的中性蛋白酶活力始終高于Control組，這很可能與醬醪發(fā)酵初期低溫脅迫有關，低溫脅迫發(fā)酵下的醬醪pH較高且溫度低，有利于保持蛋白酶的活力和穩(wěn)定性，延緩酶活力下降的速率[21]。

2.3 醬油成品的基本理化指標

不同釀造工藝下發(fā)酵60 d的醬油成品的理化指標見表1，總氮、氨氮、總酸和總糖含量是衡量醬油產品的重要質量指標。低溫脅迫組與對照組的總氮含量分別是1.79和1.78，差異不顯著(P>0.05)，這與Wu等人的報道一致，說明醬醪發(fā)酵溫度不是影響最終醬油產品總氮含量的重要因素。此外，除兩組醬油成品的pH、總酸含量有顯著性差異以外，其他理化指標如總氮、氨氮、總糖均沒有顯著性差異(P>0.05)。但是兩組樣品的總氮、氨氮均達到了特級醬油的標準(總氮≥1.50 g/dL，氨氮≥0.80 g/dL)。低溫脅迫組醬油成品的pH值略高于對照組，這更有利于谷氨酰胺酶和蛋白酶等酶類發(fā)揮作用，促進鮮味及其他風味物質的產生。

表1 不同釀造工藝發(fā)酵60 d后醬油成品的理化指標Table 1 The physicochemical indexes of soy sauce products after 60 days’ fermentation under different brewing process

注：結果均為平均值±標準偏差(n=3)；表中同行標注不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。

2.4 醬油成品的游離氨基酸組成

氨基酸是醬油的重要營養(yǎng)組成部分，游離氨基酸的味道、含量高低和百分含量組成影響著醬油的風味，一定程度上反映了醬油品質的優(yōu)劣。不同釀造工藝發(fā)酵60 d后醬油成品的游離氨基酸組成見表2。根據不同氨基酸呈味特性的不同，可大體將氨基酸分成甜味、鮮味、苦味和無味四類。低溫脅迫組(LT組)的甜味氨基酸(1679.21 mg/mL)含量和鮮味氨基酸(1500.42 mg/mL)含量顯著高于對照組(Control組)的甜味氨基酸(1669.56 mg/mL)和鮮味氨基酸(1445.57 mg/mL)含量，而苦味氨基酸(2625.82 mg/mL)含量顯著低于對照組(Control組)的苦味氨基酸(2698.11 mg/mL)含量。這說明低溫脅迫發(fā)酵工藝有利于提高醬油成品的甜味和鮮味，并降低苦味。同時，兩組的無味類氨基酸含量和總氨基酸含量沒有明顯的差異。醬油的鮮味主要來源于醬油成品中谷氨酸，游離的谷氨酸主要是由谷氨酰胺酶水解谷氨酰胺產生的[22]。低溫脅迫組(LT組)樣品的谷氨酸(Glu)含量顯著高于對照組(Control組)，這與醬醪發(fā)酵初期低溫脅迫組的谷氨酰胺酶活力顯著高于對照組密切相關。因此，低溫脅迫發(fā)酵工藝有助于醬油成品的增甜、增鮮，進而提高醬油成品的品質。

表2 不同釀造工藝發(fā)酵60 d后醬油成品的游離氨基酸組成分析Table 2 The composition analysis of free amino acids of soy sauce products after 60 days’ fermentation under different brewing process mg/mL

注：結果均為平均值±標準偏差(n=3)；表中同行標注不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。

2.5 醬油成品的滋味感官分析

不同釀造工藝發(fā)酵60 d后醬油成品的滋味感官分析結果見圖3。兩種不同釀造工藝下醬油成品的感官分析結果差異顯著，尤其是鮮味指標。低溫脅迫組(LT組)的鮮味和厚味明顯高于對照組(Control組)，醬油的厚味是指口感的豐富度、連續(xù)性，可以協調醬油的整體口感。低溫脅迫組(LT組)的咸味稍弱于對照組(Control組)，可以使味道更溫和協調，從而突出鮮味。同時，兩者的甜味、苦味較弱且無明顯差異。因此，醬醪釀造初期低溫脅迫發(fā)酵的醬油相對于傳統工藝釀造的醬油滋味更加濃郁、鮮美。

圖3 不同釀造工藝下發(fā)酵60 d醬油成品的感官分析Fig.3 Sensory analysis of soy sauce products after 60 days’ fermentation under different brewing process

3 結論

醬醪釀造初期的低溫脅迫工藝對醬油pH值的影響很大，低溫脅迫可以延緩pH值的下降，使醬醪處于中性或弱酸性，更有利于發(fā)揮微生物和酶系的作用，從而促進更多鮮味氨基酸的產生。

不同釀造工藝下醬醪的谷氨酰胺酶、中性蛋白酶活力差異顯著(P<0.05)。隨發(fā)酵時間的延長，谷氨酰胺酶和蛋白酶活力均不斷降低。但低溫脅迫發(fā)酵有利于保留酶活力，促進曲霉菌絲體自溶釋放更多谷氨酰胺酶，使原料分解得更充分。

不同釀造工藝下醬油成品的總氮、氨氮和總糖含量無顯著差異?？偟?、氨氮均達到了特級醬油的標準(總氮≥1.50 g/dL，氨氮≥0.80 g/dL)。而低溫脅迫發(fā)酵組(LT組)的總酸含量較對照組(Control組)低。

醬醪釀造初期的低溫脅迫工藝對醬油成品的游離氨基酸含量影響很大，顯著提高了鮮味氨基酸和甜味氨基酸的比例，降低了苦味氨基酸的比例，有助于提高醬油品質。

醬醪釀造初期的低溫脅迫工藝突出了醬油的鮮味和厚味，使得到的醬油成品更加濃郁醇厚。