姜淼，李欣怡，宋志遠(yuǎn)，趙前程，李智博

(大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

海參營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，具有高蛋白、低脂肪、低膽固醇等特點(diǎn)，富含多種微量元素，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高[1]，并且具有增強(qiáng)免疫力、延緩衰老、抗腫瘤等生物功效[2,3]。在加工海參的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生海參腸和性腺等副產(chǎn)物，研究表明海參腸的蛋白質(zhì)和脂肪含量高于海參本身[4]，具有與海參相似的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和抗氧化、抗疲勞、增強(qiáng)免疫力、降血糖、降血脂、抗腫瘤等功效[5]。海參腸中的抗氧化活性物質(zhì)主要包括多肽、多糖、酚類和黃酮類物質(zhì)等。海參腸、卵在日本被稱作海參花，可以加工成調(diào)味品、固體飲料等食品。海參腸中的釩元素、硒元素高于海參體壁。釩元素對(duì)機(jī)體的正常糖代謝有重要作用，硒元素可以調(diào)節(jié)人體肌肉系統(tǒng)、增強(qiáng)免疫力[6]。海參內(nèi)臟中含有大量的游離氨基酸，其中鮮味氨基酸Glu和甜味氨基酸Ala、Gly的含量很高，使其具有鮮美的味道。目前，對(duì)于海參腸的加工利用研究尚處于初級(jí)階段，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)海參腸的產(chǎn)品大規(guī)模銷售，部分原因是海參腸的腥味較重，限制了產(chǎn)品的應(yīng)用推廣。

研究表明Plastein反應(yīng)能通過(guò)減少游離氨基酸含量、去除水解物的苦味、腥味[7]，改變蛋白質(zhì)的功能特性。Plastein反應(yīng)又稱塑蛋白反應(yīng)或類蛋白反應(yīng)，可以使肽段通過(guò)縮合作用、轉(zhuǎn)肽作用將肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)改變[8]。一般可以理解為Plastein反應(yīng)是一種水解的逆反應(yīng)，通過(guò)調(diào)整水解產(chǎn)物的底物濃度(通常為20%～50%)，也可加入其他原料來(lái)源的肽、氨基酸衍生物，使酶解物發(fā)生縮合、重組形成新的肽段，從而實(shí)現(xiàn)腥味脫除和功能的改變。Plastein反應(yīng)只添加食品級(jí)的酶，不會(huì)產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)，因而可以用于海參腸產(chǎn)品的脫腥。

國(guó)內(nèi)對(duì)水產(chǎn)品副產(chǎn)物采用酶技術(shù)將優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)充分利用，制成調(diào)味料、魚(yú)醬、濃縮蛋白等產(chǎn)品。近年來(lái)，隨著海洋生物研究的加深，海洋生物的功能性蛋白和特殊活性物質(zhì)更多地用于功能性食品以及藥物開(kāi)發(fā)。本課題主要對(duì)海參腸進(jìn)行酶解脫腥處理，制備調(diào)味料基料，為海參副產(chǎn)物精加工和高價(jià)值產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)進(jìn)行一定探索。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海參腸：遼寧省大連市棒棰島有限公司；鄰苯二甲醛、茚三酮：上海市阿拉丁工業(yè)公司；四硼酸鈉：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；十二烷基硫酸鈉：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；β-疏基乙醇(分析純)：天津市福晨化學(xué)試劑廠；檸檬酸鈉、風(fēng)味蛋白酶(8×106U/g)、堿性蛋白酶(2×106U/g)：天津市諾奧科技發(fā)展有限公司；胃蛋白酶(8×106U/g)：北京索萊寶科學(xué)技術(shù)有限公司；中性蛋白酶(2×106U/g)：青島吉寶中新國(guó)際貿(mào)易有限公司；木瓜蛋白酶(8×106U/g)：天津諾奧酶生產(chǎn)力促進(jìn)有限公司；胰蛋白酶(5×106U/g)：蘇州美高美生物科技有限公司。

日立L8900氨基酸分析儀 日本株式會(huì)社日立制作所；FD-1型冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；R501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 沈陽(yáng)凱威爾實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵 鄭州博科儀器設(shè)備有限公司。

1.2 海參腸調(diào)味料工藝流程

新鮮的海參腸→清洗、除去雜質(zhì)→勻漿(一定料液比)→調(diào)pH→酶解(一定加酶量及酶解時(shí)間)→沸水浴滅酶→離心→濃縮→凍干→得到酶解物→加水溶解(一定底物濃度)→加中性蛋白酶(一定加酶量)→Plastein反應(yīng)(一定溫度、時(shí)間)→得到海參腸調(diào)味料。

1.3 海參腸的酶解工藝優(yōu)化

1.3.1 單酶的篩選

本實(shí)驗(yàn)以海參腸為酶解原料，采用中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶進(jìn)行酶解，各酶的反應(yīng)條件見(jiàn)表1。

表1 5種酶的最適溫度及pHTable 1 The optimum temperature and pH value of five enzymes

其中固定料液比1∶8(g/mL)，加酶量2.0%，酶解時(shí)間4 h，指標(biāo)為感官評(píng)分。

1.3.2 風(fēng)味蛋白酶的酶解條件優(yōu)化

采用風(fēng)味蛋白酶，以感官評(píng)價(jià)為指標(biāo)進(jìn)行酶解。

控制酶解時(shí)間4 h，加酶量0.6%，料液比1∶8，對(duì)酶解溫度(40，45，50，55，60 ℃)進(jìn)行單因素篩選。

控制酶解溫度50 ℃，加酶量0.6%，料液比1∶8，對(duì)酶解時(shí)間(2，3，4，5，6 h)進(jìn)行單因素篩選。

控制酶解時(shí)間4 h，酶解溫度50 ℃，料液比1∶8，對(duì)加酶量(0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%)進(jìn)行單因素篩選。

控制酶解時(shí)間4 h，酶解溫度50 ℃，加酶量0.5%，對(duì)料液比(1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10)進(jìn)行單因素篩選。

1.3.3 感官測(cè)定

邀請(qǐng)若干名食品專業(yè)的研究生進(jìn)行前期感官評(píng)價(jià)測(cè)試的篩選，最終選取10 名(男性5名，女性5名) 進(jìn)行培訓(xùn)并組成感官評(píng)定小組，每個(gè)樣品的感官評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)去掉最高分和最低分后取算術(shù)平均值，感官評(píng)分表見(jiàn)表2[9]。

表2 感官評(píng)價(jià)表Table 2 The sensory evaluation table

1.4 Plastein反應(yīng)脫腥工藝優(yōu)化

1.4.1 Plastein反應(yīng)單酶的篩選

以海參腸酶解液為原料，以游離氨基酸減少量和脫腥率為指標(biāo)，選用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶進(jìn)行Plastein反應(yīng)。固定底物濃度30%，加酶量3%，反應(yīng)時(shí)間1 h，其中反應(yīng)溫度與酶種類有關(guān)，木瓜蛋白酶選用55 ℃，中性蛋白酶選用50 ℃，堿性蛋白酶選用55 ℃，胃蛋白酶選用37 ℃。

1.4.2 單因素實(shí)驗(yàn)

以游離氨基酸的減少量和脫腥率為指標(biāo)，選取中性蛋白酶進(jìn)行如下單因素實(shí)驗(yàn)。

控制底物濃度為30%，在50 ℃的條件下反應(yīng)1 h，對(duì)加酶量(1%、2%、3%、4%、5%)進(jìn)行篩選。

根據(jù)上組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，控制加酶量為3%，50 ℃條件下反應(yīng)1 h，對(duì)底物濃度(10%、20%、30%、40%、50%)進(jìn)行篩選。

根據(jù)上組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，控制加酶量為3%，底物濃度為20%，在50 ℃下反應(yīng)，對(duì)反應(yīng)時(shí)間(0.5,1,1.5,2,2.5 h)進(jìn)行篩選。

根據(jù)上組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，控制加酶量為3%，底物濃度為20%，反應(yīng)時(shí)間為1 h，對(duì)反應(yīng)溫度(30,40,50,60,70 ℃)進(jìn)行篩選。

1.4.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用Box-Benhnken設(shè)計(jì)3因素3水平的實(shí)驗(yàn)方案，選取加酶量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，以游離氨基酸的減少量為指標(biāo)，響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素及水平Table 3 The factors and levels of response surface design

1.4.4 指標(biāo)的測(cè)定

1.4.4.1 Plastein反應(yīng)后修飾物游離氨基酸的測(cè)定

以鄰苯二甲醛法為基礎(chǔ)(OPA法)，稍作改進(jìn)。配制濃度分別為0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 mg/mL的L-亮氨酸溶液。取0.2 mL不同濃度的 L-亮氨酸溶液、4 mL配制好的OPA試劑，混勻后在空氣中靜置5 min，在波長(zhǎng)340 nm下測(cè)定吸光度值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.41145x+0.02649 (R2=0.9998) 進(jìn)行分析。

將Plastein修飾物進(jìn)行離心，離心條件為4 ℃，12000 r/min，20 min。取0.2 mL稀釋后的上清液，加入4 mL配制好的OPA試劑，混勻，在空氣中靜置5 min后，在340 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。按照下式計(jì)算游離氨基酸的減少量。

游離氨基酸的減少量(%)=反應(yīng)前的游離氨基酸含量-反應(yīng)后的游離氨基酸含量。

1.4.4.2 Plastein反應(yīng)后修飾物脫腥率的測(cè)定

根據(jù)感官評(píng)價(jià)方法對(duì)Plastien反應(yīng)前的樣品和反應(yīng)后的修飾物進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，按照下式計(jì)算脫腥率。

脫腥率(%)=感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)/10分×100。

1.5 Plastein反應(yīng)前后游離氨基酸組成

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測(cè)定》方法[10]，對(duì)樣品中的游離氨基酸組成進(jìn)行測(cè)定。

樣品處理：稱取樣品0.1 g，經(jīng)真空濃縮干燥后定容，取2 mL樣品進(jìn)樣，用氨基酸分析儀進(jìn)行分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，得到平均值及方差，并用Origin軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 海參腸酶解條件優(yōu)化

2.1.1 單酶的篩選

風(fēng)味蛋白酶包含了內(nèi)切酶和外切酶兩種活性，可以較大程度地去除苦味的肽鏈，將其降解為氨基酸。另一方面，加入風(fēng)味蛋白酶使風(fēng)味前體物水解，釋放風(fēng)味物質(zhì)，可以在一定程度上增強(qiáng)和改善食品風(fēng)味。加入風(fēng)味蛋白酶的實(shí)驗(yàn)組具有淡淡的海鮮鮮味，且無(wú)其他異味。

圖1 酶種類對(duì)海參腸原料酶解的影響Fig.1 Effect of enzyme types on enzymatic hydrolysis of sea cucumber intestine

由圖1可知，加入風(fēng)味蛋白酶的實(shí)驗(yàn)組，感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)優(yōu)于加入其他4種蛋白酶的實(shí)驗(yàn)組。

2.1.2 風(fēng)味酶酶解單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.2.1 酶解溫度的篩選

酶解溫度過(guò)高或過(guò)低時(shí)，蛋白酶的活性受到抑制。當(dāng)酶解溫度趨于酶的最適溫度時(shí)酶解的效率最高。

圖2 酶解溫度對(duì)海參腸原料酶解的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on enzymatic hydrolysis of sea cucumber intestine

由圖 2可知，隨著溫度升高，風(fēng)味蛋白酶酶解液的鮮味呈先增高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)酶解溫度為50 ℃時(shí)，感官評(píng)價(jià)的評(píng)分最高，因此風(fēng)味蛋白酶的最適溫度為50 ℃。

2.1.2.2 酶解時(shí)間的篩選

在酶解過(guò)程中，不同酶解階段降解釋放的肽和氨基酸的種類和含量不同，導(dǎo)致最終感官特性出現(xiàn)差異。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)海參腸原料酶解的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on enzymatic hydrolysis of sea cucumber intestine

由圖3可知，海參腸酶解液的鮮味強(qiáng)度隨著酶解時(shí)間的增加呈先增加再降低的趨勢(shì)。當(dāng)酶解時(shí)間為4 h時(shí)，鮮味口感最佳。

2.1.2.3 加酶量的篩選

圖4 加酶量對(duì)海參腸原料酶解的影響Fig.4 Effect of enzyme additive amount on enzymatic hydrolysis of sea cucumber intestine

由圖4可知，底物的水解作用隨著酶添加量的增加逐漸增強(qiáng)，釋放出更多的呈味氨基酸，酶解液呈現(xiàn)較好的鮮味，但當(dāng)加酶量超過(guò)0.5%時(shí)，肽鏈進(jìn)一步被水解，釋放出具有苦味的小肽，使感官評(píng)分下降。因此，當(dāng)加酶量為0.5%時(shí)，感官評(píng)價(jià)的評(píng)分最高。

2.1.2.4 料液比的篩選

溶液中的酶和底物需要適宜的濃度，才能更好地進(jìn)行酶解反應(yīng)。料液比在一定范圍內(nèi)，海參腸被適度酶解，呈味氨基酸釋放出來(lái)，鮮度增加。

圖5 料液比對(duì)海參腸原料酶解的影響Fig.5 Effect of ratio of material to liquid on enzymatic hydrolysis of sea cucumber intestine

由圖5可知，當(dāng)料液比為1∶8時(shí)，感官評(píng)價(jià)的評(píng)分最高，料液比1∶8為最優(yōu)的料液比。

2.2 Plastein反應(yīng)脫腥工藝優(yōu)化

經(jīng)過(guò)上述單因素優(yōu)化，獲得最佳酶解條件為：在風(fēng)味蛋白酶的作用下，底物濃度為0.5%，料液比為1∶8 (g/mL)，50 ℃條件下酶解4 h，酶解獲得的海參腸酶解液還有一定的腥味，故進(jìn)一步用Plastein反應(yīng)進(jìn)行脫腥處理，制備海參腸酶解液。

2.2.1 單酶的篩選

圖6 酶種類對(duì)游離氨基酸減少量和脫腥率的影響Fig.6 Effect of enzyme types on the reduction amount and deodorization rate of free amino acids

由圖6可知，經(jīng)中性蛋白酶催化的Plastein反應(yīng)，其游離氨基酸減少量較為明顯，木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的脫腥率效果略好于其他兩種酶的脫腥效果。在木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的作用下，將更多的苦味肽縮合、重組，改善了修飾物的風(fēng)味，提高了修飾物的鮮度。綜合考慮兩種指標(biāo)，選用中性蛋白酶作為后續(xù)Plastein反應(yīng)用酶。

2.2.2 Plastein反應(yīng)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.2.1 加酶量單因素篩選

游離氨基酸減少量和脫腥率都隨加酶量的增加呈先升高后下降的趨勢(shì)，游離氨基酸減少量增加，說(shuō)明更多具有腥苦味道的游離氨基酸結(jié)合到肽段中，從而改善了產(chǎn)品的味道。綜上，當(dāng)游離氨基酸減少量和脫腥率呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)時(shí)說(shuō)明Plastein反應(yīng)脫腥效果較好。

圖7 加酶量對(duì)游離氨基酸減少量和脫腥率的影響Fig.7 Effect of enzyme additive amount on the reduction amount and deodorization rate of free amino acids

由圖7可知，當(dāng)加酶量為3%時(shí)，游離氨基酸的減少量明顯多于其他4組，脫腥率也優(yōu)于其他4組，最終綜合考慮兩個(gè)因素，確定最優(yōu)條件為加酶量3%。

2.2.2.2 底物濃度的單因素篩選

Plastein反應(yīng)與酶解反應(yīng)的最大區(qū)別在于底物濃度的不同，Plastein反應(yīng)的底物濃度較大，這樣有利于縮合、轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的進(jìn)行。

圖8 底物濃度對(duì)游離氨基酸減少量和脫腥率的影響Fig.8 Effect of substrate concentration on the reduction amount and deodorization rate of free amino acids

由圖8可知，海參腸酶解液經(jīng)過(guò)Plastein反應(yīng)后，游離氨基酸減少量和脫腥率隨底物濃度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0%時(shí)，游離氨基酸的減少量最多，脫腥率效果也最好，說(shuō)明在此條件下，酶解液中的苦味肽段可能發(fā)生了縮合反應(yīng)，從而改變了產(chǎn)品的風(fēng)味。

2.2.2.3 酶解時(shí)間的單因素篩選

圖9 反應(yīng)時(shí)間對(duì)游離氨基酸減少量和脫腥率的影響Fig.9 Effect of reaction time on the reduction amount and deodorization rate of free amino acids

由圖9可知，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間控制在2 h時(shí)，游離氨基酸的減少量略高于其他4組，脫腥率隨反應(yīng)時(shí)間的變化較為明顯，呈先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)酶解時(shí)間為2 h時(shí)，脫腥效果較明顯，2 h之后可能苦味肽的疏水性基團(tuán)會(huì)暴露出來(lái)，使脫腥率開(kāi)始下降。綜合兩個(gè)因素考慮，最終確定最優(yōu)酶解時(shí)間為2 h。

2.2.2.4 反應(yīng)溫度的單因素篩選

圖10 反應(yīng)溫度對(duì)游離氨基酸減少量和脫腥率的影響Fig.10 Effect of reaction temperature on the reduction amount and the rate of deodorization of free amino acids

由圖10可知，當(dāng)反應(yīng)溫度在50 ℃時(shí)，游離氨基酸的減少量更為明顯；反應(yīng)溫度在50 ℃和60 ℃時(shí)，脫腥效果更為顯著。游離氨基酸的減少量作為Plastein反應(yīng)過(guò)程中的一種指示性指標(biāo)，可以反映出游離氨基酸與肽的結(jié)合能力，結(jié)合能力越強(qiáng)說(shuō)明Plastein反應(yīng)越充分。綜上，確定最優(yōu)的反應(yīng)溫度是50 ℃。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)上述模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表 4和表5。

表4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Response surface experimental design and results

表5 回歸模型方差分析Table 5 Regression model variance analysis table

注：“*”表示顯著，P<0.05；“**”表示極顯著，P<0.01。

所建立的Plastein反應(yīng)的模型P<0.0001，說(shuō)明響應(yīng)面回歸模型達(dá)到極顯著水平。所得到交互項(xiàng)AC及所有的二次項(xiàng)均極顯著(P<0.0001)，BC顯著(P<0.05)，說(shuō)明加酶量和時(shí)間以及溫度和時(shí)間的交互作用對(duì)游離氨基酸的減少量影響顯著。P值越小，F(xiàn)值越大則說(shuō)明相應(yīng)變量的顯著性越高，本次的模型中各變量對(duì)響應(yīng)值影響的先后順序依次為時(shí)間>加酶量>溫度。此模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9826，校正后的相關(guān)系數(shù)RAdj2=0.9603，說(shuō)明游離氨基酸的減少原因有98%取決于所選因素。

運(yùn)用Design Expert 8.0.6 對(duì)表5 中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，建立二次響應(yīng)面回歸模型方程為：Y=47.82-0.18A+0.163B-0.22C+0.86AB-3.29AC+1.35BC-4.47A2-3.99B2-4.66C2。

根據(jù)上述建立的回歸方程可以繪制三維空間的響應(yīng)曲面，結(jié)果見(jiàn)圖11～圖13。所擬合的相應(yīng)曲面的形狀和等高線可以直觀地反映出各因素對(duì)響應(yīng)值的影響趨勢(shì)和兩兩變量之間的交互作用的程度[11,12]。

圖11 溫度與加酶量對(duì)游離氨基酸減少量交互影響的響應(yīng)曲面Fig.11 Response surface of the interaction effect of temperature and enzyme additive amount on the reduction amount of free amino acids

圖13 反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度對(duì)游離氨基酸減少量交互影響的響應(yīng)曲面Fig.13 Response surface of the interaction effect of reaction time and reaction temperature on the reduction amount of free amino acids

經(jīng)Design Expert 軟件分析可得到Plastein反應(yīng)的最優(yōu)條件為中性蛋白酶量3.40%，底物濃度20%，反應(yīng)時(shí)間1.69 h，反應(yīng)溫度57.08 ℃。綜合單因素實(shí)驗(yàn)和實(shí)際操作情況，應(yīng)用Plastein反應(yīng)對(duì)海參腸進(jìn)行脫腥的工藝確定為：選用中性蛋白酶，加酶量為3.40%，底物濃度為20%，反應(yīng)時(shí)間為100 min，反應(yīng)溫度為57 ℃。在此條件下得到的游離氨基酸減少量為42.90%，預(yù)測(cè)值為43.98%，實(shí)際值與理論預(yù)測(cè)值相比相差了1.08%，說(shuō)明該模型能很好地預(yù)測(cè)Plastein反應(yīng)的游離氨基酸減少量[13]。

2.4 Plastein反應(yīng)前后游離氨基酸組成

分別對(duì)海參腸的酶解液和最優(yōu)條件下Plastein反應(yīng)后的修飾物進(jìn)行游離氨基酸組成的測(cè)定，具體組成結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 Plastein反應(yīng)前后氨基酸種類及含量的組成Table 6 Composition of amino acid types and content before and after Plastein reaction

氨基酸的組成對(duì)海參腸調(diào)味料的呈味起關(guān)鍵作用，對(duì)Plastein的酶解液和修飾物進(jìn)行了游離氨基酸的測(cè)定，反應(yīng)前后的氨基酸種類沒(méi)有明顯的變化，但是含量組成有較為明顯的不同。經(jīng)過(guò)Plastein反應(yīng)后，必需氨基酸從反應(yīng)前的45.67%增加到46.88%，說(shuō)明該方法可以有效避免傳統(tǒng)活性炭、酵母等方法脫腥使氨基酸損失的弊端[14]。反應(yīng)后的6種呈味氨基酸(Gly、Ala、Asp、Thr、Ser和Glu)占總氨基酸含量的35.77%[15,16]，因此脫腥后的修飾物有一定的海鮮風(fēng)味。有研究表明[17]，肽鏈中疏水氨基酸比例增加，會(huì)產(chǎn)生苦味，經(jīng)過(guò)Plastein反應(yīng)后游離氨基酸中的疏水性氨基酸含量均有增加，可見(jiàn)本來(lái)存在于海參腸肽鏈中的疏水氨基酸被置換出來(lái)，從而改善了海參腸調(diào)味料的味道。

3 討論

海參腸具有高蛋白、低膽固醇，富含多種微量元素，是極具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的海參加工副產(chǎn)物，但是其加工利用一直受其腥味的制約。趙曉玥以海參腸、卵為原料，采用中性蛋白酶與木瓜蛋白酶組合酶解和風(fēng)味蛋白酶分步酶解的方法，獲得口感、風(fēng)味較好的酶解產(chǎn)物。

本研究首次采用酶法聯(lián)合Plastein反應(yīng)對(duì)海參腸進(jìn)行脫腥，并制備海參腸調(diào)味料。目前，Plastein反應(yīng)多用于提高生物活性肽的活性，韓青等人將該方法用于牡蠣ACE抑制肽的制備，有效提高了ACE的抑制率。沈晴晴[18]采用該方法制備海參ACE抑制肽，得到高活性的ACE抑制肽序列結(jié)構(gòu)。

Plastein反應(yīng)用于脫腥方面的研究比較少，現(xiàn)有的脫腥手段多是物理掩蓋、吸附法和包埋法。張淼等[19]采用CaCl2和綠茶質(zhì)量比為1∶1的復(fù)合脫腥劑對(duì)銀鱈魚(yú)進(jìn)行脫腥，主要降低了魚(yú)類中富含的三甲胺，防止氧化三甲胺的形成，從而阻止了腥味的產(chǎn)生。邢貴鵬等[20]采用紫蘇葉、香芹液及白醋對(duì)羅非魚(yú)加工副產(chǎn)物進(jìn)行脫腥處理，主要是除去富含腥味的醛類、醇類等物質(zhì)，脫腥處理后魚(yú)體帶有天然的植物香味，且保留了原有的風(fēng)味。趙曉玥使用大孔樹(shù)脂脫腥方法對(duì)海參腸進(jìn)行脫腥處理，其方法原料損耗大，吸附效果不好，脫腥效率低。Plastein反應(yīng)脫腥優(yōu)勢(shì)在于只加入食品級(jí)的酶，操作簡(jiǎn)單，而且不會(huì)造成蛋白質(zhì)的損失，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。但Plastein反應(yīng)脫腥的具體作用機(jī)理尚不是很明確，初步推測(cè)是通過(guò)重組、縮合等反應(yīng)改變?cè)须亩蔚男蛄校瑥亩纳屏诵揎椢锏娘L(fēng)味，具體反應(yīng)機(jī)理還需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究采用酶法聯(lián)合Plastein反應(yīng)對(duì)海參腸進(jìn)行脫腥，制備出一種新型的海參腸調(diào)味料。海參腸調(diào)味料制備的最優(yōu)酶解工藝為：風(fēng)味蛋白酶，加酶量0.5%，酶解時(shí)間4 h，酶解溫度50 ℃，料液比為1∶8。制備的海參腸酶解液通過(guò)Plastein反應(yīng)進(jìn)行脫腥處理，經(jīng)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到最佳的脫腥工藝為中性蛋白酶加酶量3.4%，底物濃度20%，溫度57 ℃，時(shí)間100 min。對(duì)海參腸酶解液脫腥前后游離氨基酸組成和含量的分析表明，該方法確實(shí)改變了肽段的氨基酸組成，且不會(huì)造成氨基酸的損失。最終得到脫腥后的調(diào)味料味道鮮美，基本沒(méi)有腥味。