張斌，王曉聞

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801)

以酸漿水為點漿水制作的酸漿豆腐，是山西大同最北部廣靈縣的特色。酸漿水為淡黃色液體，澄清透明，味道偏酸，是由當(dāng)?shù)匮赜迷械陌l(fā)酵液，通過向其中不斷補充新鮮的水，并露天自然發(fā)酵而成。由此制作而成的豆腐，不僅有濃郁的豆香，而且有獨特的酵香，推測這可能與酸漿水中含有的微生物有關(guān)。關(guān)于酸漿水中微生物的組成情況，國內(nèi)外報道較少，因此本文將通過高通量測序技術(shù)對酸漿水中的微生物組成情況進行分析，并運用傳統(tǒng)的分離純化方法和試劑盒鑒定酸漿水中的微生物。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 原料

取自山西省大同市廣靈縣某豆業(yè)有限公司的新鮮酸漿水，取澄清透明、無泡沫的酸漿水于無菌離心管中，低溫貯藏運送至實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基

細(xì)菌培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯。

分離乳酸菌用培養(yǎng)基：MRS 瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基，購于索萊寶生物科技有限公司。

API 50CHL乳桿菌鑒定試劑盒[1]：購于法國生物梅里埃(中國)有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；HPP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BS 224S電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；0.25 μm×25 mm針式過濾器及相應(yīng)規(guī)格濾膜 頗爾(中國)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 高通量測序技術(shù)對酸漿水中微生物分類組成的探究[2-5]

在超凈工作臺的無菌環(huán)境中，將酸漿水原液利用針式過濾器收集在濾膜上，共收集10片濾膜，密封于無菌塑封袋中，置于-80 ℃保存，之后低溫運送至美吉云生物公司進行檢測。

1.2.2 酸漿水原液中微生物的富集

取酸漿水于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，使微生物富集。

1.2.3 細(xì)菌的篩選

取擴大培養(yǎng)后的原液轉(zhuǎn)入營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，采用平板劃線法培養(yǎng)，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。待菌落長出，挑取單菌落使用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)24 h。再轉(zhuǎn)為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進行分離篩選[6]，直至長出單菌落。

1.2.4 乳酸菌的分離純化

取經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)基分離篩選的細(xì)菌轉(zhuǎn)入MRS瓊脂培養(yǎng)基進行平板劃線培養(yǎng)。分成兩類培養(yǎng)，一類為好氧培養(yǎng)，另一類為厭氧培養(yǎng)。兩種培養(yǎng)均需在37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。待菌落長出，挑取單菌落用MRS肉湯培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng)，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。再將其轉(zhuǎn)入MRS瓊脂培養(yǎng)基進行分離純化[7]，重復(fù)此操作3次。

1.2.5 菌落的培養(yǎng)特征觀察

取菌落分散性較好、單一菌落豐富的培養(yǎng)皿，對其進行菌落的培養(yǎng)特征觀察[8]。

1.2.6 菌種的生化鑒定

使用API CHL培養(yǎng)基和API 50 CH 試劑條對菌株進行49項生化試驗鑒定，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24，48 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序結(jié)果分析

通過對高通量測序技術(shù)數(shù)據(jù)進行處理與分析，得到酸漿水中微生物的分類組成情況。

2.1.1 OTU物種分類統(tǒng)計

通過聚類操作，對樣本所有序列進行OTU劃分，并對97%相似水平下的OTU進行生物信息統(tǒng)計分析，可得到一個樣本測序結(jié)果中菌種和菌屬的數(shù)目情況。從科水平到種水平的OTU總數(shù)表見表1，共有10個科，13個屬，17個種，其中有7個屬沒有注釋到種水平。伯克氏菌科的OTU總數(shù)為28，醋酸桿菌科的OTU總數(shù)為544，乳桿菌科的OTU總數(shù)為43318，諾卡氏菌科為6，丙酸桿菌科為2，葡萄球菌科為19，纖細(xì)桿菌目為8，莫拉氏菌科為5，交替單胞菌科為5，色桿菌科為9。結(jié)果表明：從科水平、屬水平到種水平，乳酸桿菌的OTU總數(shù)都處于優(yōu)勢地位。

表1 從科到種的OTU總數(shù)表Table 1 The total number of OTU from family to genus

續(xù) 表

2.1.2 群落組成及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

基于OTU數(shù)據(jù)表，利用R語言工具作圖，在屬水平上統(tǒng)計樣本的物種組成以及各物種的相對豐度，可制得群落餅圖，見圖1。酸漿水中的微生物群落中，乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的物種豐度為43318，占比98.58%；醋酸桿菌屬(Acetobacter)的物種豐度為544，占比1.24%；其他菌屬的物種豐度為82，占比0.18%。同樣地，基于OTU數(shù)據(jù)表，選擇屬水平上分類信息對應(yīng)的序列，根據(jù)最大似然法ML(maximum likelihood)，可構(gòu)建屬水平上的系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2。

圖1 屬水平上的物種豐度餅圖Fig.1 Pie chart of species abundance at genus level

圖2 屬水平上的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree at genus level

由圖2可知，酸漿水中的微生物群落從屬水平上可大致分為三類：一類是乳酸桿菌屬(Lactobacillus)，一類是由同一結(jié)點進化分支，兩兩之間互有親緣關(guān)系的菌屬，包括醋酸桿菌屬(Acetobacter)、羅爾斯通氏菌屬(Ralstonia)、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、福格斯氏菌屬(Vogesella)、球衣菌屬(Sphaerotilus)、纖毛菌屬(Leptothrix)、萊茵海默氏菌屬(Rheinheimera)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、紅球菌屬(Rhodococcus)、Cutibacterium以及Norank_o_JGI_0000069-P22，一類是葡萄球菌屬(Staphylococcus)。在這4類中，由圖2右邊的柱形圖可知，乳酸桿菌屬的柱形圖長度最長，即占比最高。綜上所述，在酸漿水微生物的群落組成中，因乳酸桿菌屬的物種豐度占比極高，由此可得乳酸桿菌為優(yōu)勢菌。

2.2 酸漿水中微生物的分離純化結(jié)果

將酸漿水樣品進行細(xì)菌增殖、反復(fù)分離純化后，得到66株乳酸菌。在好氧條件下培養(yǎng)得到36株菌。在厭氧條件下培養(yǎng)時，觀察發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中的菌落生長分布出現(xiàn)分層現(xiàn)象，說明存在兼性厭氧性乳酸菌，最后分離得到30株厭氧或兼性厭氧乳酸菌。

2.3 菌落的培養(yǎng)特征觀察

通過觀察分離培養(yǎng)得到所有菌落的特征[9]，確定了3株菌，分別為乳酸菌L1、乳酸菌L2、乳酸菌L3，其特征見表2。

表2 菌落的培養(yǎng)特征Table 2 Culture characteristics of colonies

2.4 菌種的生化特征鑒定

根據(jù)API 50CHL乳桿菌鑒定試劑盒的原理(乳酸菌發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)酸，會使pH下降，使指示劑變色)，將其在37 ℃恒溫培養(yǎng)24，48 h，通過對照比色卡判讀兩次培養(yǎng)的結(jié)果，得到構(gòu)成菌種的生化圖譜；通過對照數(shù)據(jù)庫即可得到菌名和可靠的鑒定結(jié)果。生化特征鑒定結(jié)果見表3。

表3 API 50CHL生化鑒定結(jié)果Table 3 Biochemical identification results of API 50CHL

續(xù) 表

2.5 菌種的鑒定結(jié)果

通過對菌落的培養(yǎng)特征進行觀察，根據(jù)API 50CHL乳桿菌試劑盒的生化鑒定結(jié)果，并對照鑒定系統(tǒng)的生化圖譜，可以得出：乳酸菌L1為乳明串珠菌(Leuconostoclactis)，鑒定百分率為92%，T指數(shù)為0.56(鑒定百分?jǐn)?shù)越接近100%，T指數(shù)越接近1，鑒定結(jié)果越好)，共有27株；乳酸菌L2為德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.lactis)，鑒定百分率為77.8%，T指數(shù)為0.99，共有13株；乳酸菌L3則為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，鑒定百分率為82%，T指數(shù)為0.23，共有26株。3種乳酸菌均為乳桿菌屬，與高通量測序結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

酸漿水點豆腐制成的豆制產(chǎn)品在廣靈縣一帶由來已久，但是由于酸漿水獨特的地域特性，以及當(dāng)?shù)氐男∽鞣皇缴a(chǎn)經(jīng)營模式，鮮少有人了解到酸漿水的獨特存在，同時對酸漿水的研究也少之又少。本文通過高通量測序技術(shù)與傳統(tǒng)的分離純化相結(jié)合的方法，以及API 50CHL乳桿菌鑒定試劑盒對酸漿水中的微生物群落組成進行分析，結(jié)果表明：酸漿水中的優(yōu)勢菌群為乳酸桿菌；從酸漿水中分離出66株乳酸菌，其中好氧菌為36株，厭氧或兼性厭氧菌為30株；經(jīng)試劑盒生化鑒定，得到3種乳酸桿菌L1、L2、L3，其中L1為乳明串珠菌(Leuconostoclactis)，有27株；L2為德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.lactis)，有13株；L3為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，有26株。

L2德氏乳桿菌是最具有經(jīng)濟價值的發(fā)酵乳酸菌之一，它產(chǎn)酸能力強[10]，分解代謝時可以產(chǎn)生使食物具有特殊風(fēng)味的酸類和醇類，同時還能改善腸道微生態(tài)平衡，抑制有害物質(zhì)產(chǎn)生，提高機體免疫力。L3植物乳桿菌在繁殖過程中能產(chǎn)生特有的乳酸桿菌素[11]，這是一種生物型的防腐劑，可以減少化工降解素的用量，降低養(yǎng)殖成本。植物乳桿菌還具有保健作用，它可以維持腸道內(nèi)菌群平衡，對致病菌也有抑制作用，甚至可以抑制腫瘤細(xì)胞的形成。通過初步鑒定得出的這些菌，或許可以為酸漿水以后的工業(yè)化生產(chǎn)及經(jīng)營發(fā)展提供一種新的思路。