蔡靜靜，徐曉裕，張 艷，張亞川，魏小晶，闞澤宇，倪永清

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

雙歧桿菌（Bifidobacterium）是人體腸道內(nèi)一類(lèi)重要的益生菌，具有抗腫瘤、抗氧化、降膽固醇、維持腸道菌群平衡和免疫調(diào)節(jié)等生理功能[1-6]。雙歧桿菌胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）是其生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，屬于高分子生物聚合物，它們附著在細(xì)胞表面或分泌到環(huán)境中[7]。目前報(bào)道的產(chǎn)生EPS的雙歧桿菌包括B. animalis、B. breve、B. longum、B. bifidum、B. longumsubsp. infantis、B. pseudocatenulatum和B. adolescentis[8]。近年來(lái)，關(guān)于乳酸菌EPS的功能及其在奶制品中的應(yīng)用報(bào)道有很多，然而關(guān)于雙歧桿菌EPS的研究卻很少。研究表明，雙歧桿菌產(chǎn)生的EPS不僅可以調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)并發(fā)揮其生物活性作用促進(jìn)宿主健康[9]，還可以作為保護(hù)層幫助雙歧桿菌在胃腸道逆環(huán)境中存活[10]，Alp等[11]從母乳喂養(yǎng)的嬰兒糞便中分離出31 株雙歧桿菌，發(fā)現(xiàn)EPS產(chǎn)量與其耐酸耐膽鹽能力之間呈正相關(guān)。高產(chǎn)EPS是選擇益生雙歧桿菌的一個(gè)重要特征[12]。

生物體內(nèi)的氧化應(yīng)激是由活性氧（reactive oxygen species，ROS）的負(fù)荷或積累增加引起的，當(dāng)ROS在生物體中的積累過(guò)多時(shí)會(huì)對(duì)DNA、碳水化合物、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)造成損害[13]，一般使用抗氧化劑中和這些ROS。國(guó)內(nèi)外許多研究表明雙歧桿菌EPS具有一定的抗氧化活性，Li Shengjie等[14]發(fā)現(xiàn)從人糞便內(nèi)分離的B. bifidumWBIN03產(chǎn)生的EPS對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基有較強(qiáng)的清除能力；有學(xué)者比較了從廣西長(zhǎng)壽老人糞便中分離的B. animalisRH兩個(gè)級(jí)分EPS（中性EPS和酸性EPS）的體外抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化和DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基均顯示出抑制作用[15]。

新疆獨(dú)特的地理位置、特殊的文化習(xí)俗和飲食習(xí)慣為天然益生菌的開(kāi)發(fā)提供了豐富的資源。本研究對(duì)新疆維吾爾族腸道中篩選的雙歧桿菌進(jìn)行EPS產(chǎn)量測(cè)定，并探究其所產(chǎn)EPS的抗氧化活性，菌株在模擬胃腸液中的存活情況以及體外黏附性，進(jìn)而篩選出EPS產(chǎn)量高、抗氧化活性好且能夠以較高的數(shù)量在胃腸道中存活的雙歧桿菌，以期為后續(xù)開(kāi)發(fā)適合少數(shù)民族群體的抗氧化型產(chǎn)品提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Wilkins-Chalgren厭氧菌瓊脂參考文獻(xiàn)[16]；BSM培養(yǎng)基[17]：在MRS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上每升添加0.5 g半胱氨酸鹽酸鹽、50 mg莫匹羅星、25 mg制霉菌素；脫脂乳培養(yǎng)基[18]：每升90 g脫脂乳、3.5 g酵母提取物、3.5 g蛋白胨和10 g葡萄糖，105 ℃滅菌10 min。

DNA提取試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司；Tris堿、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、鄰苯三酚、濃鹽酸、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、無(wú)水乙醇、無(wú)水甲醇、三氯化鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）（均為分析純） 北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek儀器有限公司；pH計(jì)梅特勒-托利多儀器有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 英國(guó)Techne公司；HWS智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 太倉(cāng)市華美生化儀器廠；H2050R-2離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；厭氧培養(yǎng)箱 英國(guó)DWS公司；水平電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集及預(yù)處理

樣品采自新疆維吾爾族的嬰兒糞便及其母親糞便。使用糞便采樣器采集樣品，置于車(chē)載冰箱中-20 ℃保存，24 h之內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。

1.3.2 雙歧桿菌的分離、純化和保藏

樣品用無(wú)菌生理鹽水稀釋至10-5、10-6、10-7、10-8，分別吸取原液和樣品稀釋液100 μL涂布均勻于Wilkins-Chalgren厭氧菌瓊脂和BSM平板上，每個(gè)梯度3 個(gè)平行。將平板置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，挑取平板上的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，并使用相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，選擇具有雙歧桿菌典型特征的菌落在平板上繼續(xù)劃線(xiàn)純化，直至鏡檢菌體細(xì)胞的形態(tài)和排列方式一致。將所選菌株液體富集后加甘油和新鮮液體培養(yǎng)基用2 mL凍藏管放置于-20 ℃冰箱保藏備用。

1.3.3 雙歧桿菌的生物學(xué)鑒定

1.3.3.1 基因組DNA的提取

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株DNA。

1.3.3.2 重復(fù)基因外回文序列-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（repetitive extragenic palindromic-polymerase chain reaction，rep-PCR）指紋圖譜去重

表 1 PCR擴(kuò)增體系和程序Table 1 PCR amplification system and program

使用引物BOXA1R（5’-CTACGGCAAGG CGACGCTGACG-3’）對(duì)提取的菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。rep-PCR擴(kuò)增體系和條件如表1所示，35 個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2 g/100 mL的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，電泳結(jié)束后，在紫外凝膠成像儀中觀察電泳結(jié)果并拍照，用軟件Gel Compar II對(duì)DNA圖譜進(jìn)行聚類(lèi)分析。DNA帶型完全一致的菌株通常被認(rèn)為屬于同一物種，可據(jù)此將分離所得菌株歸為若干種系型，并從每組中選取至少1 株代表菌株進(jìn)一步測(cè)序分析。

1.3.3.3 16S rDNA片段擴(kuò)增與檢測(cè)

為確保準(zhǔn)確性，使用雙歧桿菌屬引物（Bifid-R：5’-GGTGTTCTTCCCGATATCTACA-3’；Bifid-F：5’-CTCCTGGAAACGGGTGG-3’）對(duì)去重后的菌株DNA進(jìn)一步擴(kuò)增，體系和程序如表1所示，35 個(gè)循環(huán)，選擇單一且明亮的條帶用細(xì)菌的通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’）進(jìn)行16S rDNA基因片段擴(kuò)增。擴(kuò)增體系和程序參考Prasanna等[19]的方法進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物科技有限公司測(cè)序。序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST在線(xiàn)分析，搜索與其相似性最高的序列，利用MEGA 5.0.5構(gòu)建發(fā)育樹(shù)，確定待測(cè)菌株的種屬。

1.3.4 產(chǎn)EPS雙歧桿菌的篩選

1.3.4.1 產(chǎn)糖菌株初篩

菌株活化后，吸取100 μL菌液涂布于MRS平板，另取200 μL接種至100 mL脫脂乳培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)32～48 h。觀察平板上單菌落生長(zhǎng)情況以及在脫脂乳培養(yǎng)基中的黏稠拉絲情況，并作記錄。

1.3.4.2 產(chǎn)糖菌株復(fù)篩

將初篩中明顯黏稠拉絲的菌株按2%（V/V）的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)36 h制得發(fā)酵液。發(fā)酵液4 ℃、8 000 r/min離心20 min去除菌體，將上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮為原體積的1/3，并加入3 倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇4 ℃沉淀過(guò)夜，取沉淀用超純水溶解，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的TCA溶液去除蛋白，8 000 r/min離心20 min后將上清液置于4 ℃超純水中透析48 h，每8 h換一次水。

1.3.4.3 EPS含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定EPS含量，參照文獻(xiàn)[20]配制不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，然后測(cè)定波長(zhǎng)490 nm處的吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程y=0.005x-0.011 9，R2=0.996 6，計(jì)算菌株EPS的含量。

1.3.5 菌株EPS體外抗氧化活性測(cè)定

1.3.5.1 EPS的提取

參考1.3.4.2節(jié)方法提取粗多糖，冷凍干燥得到粗多糖樣品[21]，調(diào)整糖液質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL備用。

1.3.5.2 過(guò)氧化氫自由基清除能力測(cè)定

參考文獻(xiàn)[22]，稍作修改。向0.6 mL濃度為40 mmol/L H2O2溶液中加入2.4 mL磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4），搖勻，加入1 mL樣品，振蕩混勻，室溫反應(yīng)10 min，測(cè)定體系230 nm波長(zhǎng)處的吸光度，3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)式（1）計(jì)算樣品的過(guò)氧化氫自由基清除能力：

式中：A0為未加樣品的吸光度，即以水代替樣品；A1為樣品溶液與自由基反應(yīng)后的吸光度；A2為樣品溶液的吸光度，即以水代替自由基溶液，排除樣品本身吸光度對(duì)結(jié)果的影響。

1.3.5.3 超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定

參考文獻(xiàn)[23]，稍作修改。將3 mL 50 mmol/L pH 8.2 的Tris-HCl緩沖液與1 mL樣品充分混勻，25 ℃保溫30 min，加入0.3 mL 30 mmol/L鄰苯三酚溶液，搖勻，25 ℃反應(yīng)5 min。最后向反應(yīng)體系中加入1 mL濃鹽酸以終止反應(yīng)。紫外分光光度計(jì)以Tris-HCl緩沖液調(diào)零，測(cè)定反應(yīng)體系325 nm波長(zhǎng)處吸光度。3 次平行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)式（1）計(jì)算樣品的超氧陰離子自由基清除率。

1.3.5.4 羥自由基清除能力測(cè)定

參考文獻(xiàn)[24]，稍作修改。取 1 mL樣品，加入1 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液、1 mL 9mol/L的水楊酸-乙醇溶液，振蕩混勻，立即加入1 mL 9 mmol/L的H2O2溶液以開(kāi)始發(fā)生反應(yīng)，搖勻，37 ℃反應(yīng)40 min，測(cè)定反應(yīng)體系510 nm波長(zhǎng)處吸光度，3 次平行實(shí)驗(yàn)。按式（1）計(jì)算樣品的羥自由基清除率。

1.3.5.5 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參考文獻(xiàn)[25]，稍作修改。吸取2 mL樣品，加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液，搖勻，暗反應(yīng)40 min，測(cè)定混合液517 nm波長(zhǎng)處的吸光度，3 次平行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)式（1）計(jì)算樣品的DPPH自由基清除率。

1.3.6 產(chǎn)糖菌株模擬胃腸液耐受性

1.3.6.1 模擬胃液中的存活情況

人工模擬胃液：參考Liao Ning等[26]的方法稍作修改，在每升MRS肉湯里添加3 g胃蛋白酶。將菌株以2%（V/V）的接種量接入MRS培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)28 h后，4 000 r/min離心10 min收集菌體沉淀，用磷酸鹽緩沖液洗滌菌體沉淀2 次后重懸于生理鹽水中，混勻制得菌懸液。采用稀釋涂布平板法計(jì)算此時(shí)的菌液濃度（CFU/mL）。用濃度為12 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)模擬胃液pH值至2.0、2.5、3.0、3.5、4.0，滅菌冷卻后，將1 mL菌懸液分別接入9 mL模擬胃液中，37 ℃厭氧培養(yǎng)3 h。記錄不同條件下的活菌數(shù)（CFU/mL）。每組3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。以0 h菌落總數(shù)為對(duì)照，根據(jù)式（2）計(jì)算菌株存活率：

1.3.6.2 模擬腸液中的存活情況

人工模擬腸液[26]：在每升MRS肉湯里添加1 g胰蛋白酶和3 g牛膽鹽，0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 2.5。參照1.3.6.1節(jié)方法，制備菌懸液。將1 mL菌懸液接入9 mL模擬腸液中，37 ℃厭氧培養(yǎng)3 h。記錄各菌株的活菌數(shù)（CFU/mL）。每組3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。以0 h菌落總數(shù)為對(duì)照，根據(jù)式（2）計(jì)算菌株存活率。

1.3.7 產(chǎn)糖菌株自凝聚測(cè)定

將菌株發(fā)酵液4 000 r/min離心20 min，用無(wú)菌生理鹽水洗滌2 次后用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)菌懸液濃度為107CFU/mL。取5 mL菌懸液于10 mL試管中旋渦振蕩10 s，在室溫條件下靜置5 h，每隔1 h取出菌懸液置于600 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度[27]。每組3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。菌株自凝聚率按照式（3）計(jì)算：

式中：At為時(shí)間t為1、2、3、4 h和5 h的吸光度；A0為0 h吸光度。

1.3.8 產(chǎn)糖菌株表面疏水性測(cè)定

將菌株發(fā)酵液4 000 r/min離心20 min后，用無(wú)菌生理鹽水洗滌2 次重懸于0.1 mol/L KNO3（pH 6.2）溶液中，調(diào)節(jié)菌懸液濃度為107CFU/mL，600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸光度A0。分別吸取1 mL二甲苯、乙酸乙酯、氯仿溶劑加到3 mL菌液中混勻，室溫靜置10 min后渦旋振蕩兩相體系2 min，室溫下放置20 min后取水相，測(cè)定其在600 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A1）[28]。疏水性用細(xì)菌對(duì)溶劑的黏附百分比表示，計(jì)算如式（4）所示：

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果以 ±s表示，顯著性分析采用Duncan檢驗(yàn)。采用Gel Compar II凝膠分析軟件進(jìn)行指紋圖譜聚類(lèi)分析，并使用Origin 9.0.6進(jìn)行相關(guān)圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙歧桿菌的鑒定結(jié)果

圖 1 BOXA1R擴(kuò)增菌株的rep-PCR基因指紋圖譜Fig. 1 Rep-PCR gene fingerprints of strains amplified with BOXA1R

將分離得到的73 株疑似雙歧桿菌經(jīng)rep-PCR（圖1）去重后，挑選20 株代表菌株測(cè)序，序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST在線(xiàn)分析，結(jié)果有17 株屬Bifidobacterium，3 株屬Propionibacterium。將17 株雙歧桿菌的部分16S rRNA基因序列測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST在線(xiàn)分析，并選取同源性最高的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖2?？梢钥闯?7 株雙歧桿菌分屬于5 個(gè)種，2 個(gè)亞種，菌株BF81-22、BF67-14和BF8-3屬于假長(zhǎng)雙歧桿菌（B. pseudolongum），菌株BF79-11和MF85-2屬于動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種（B. animalsubsp. lactis），菌株BF66-16屬于長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種（B. longumsubsp. infantis），菌株MFX-1屬于長(zhǎng)雙歧桿菌（B. longum），菌株MF29-4、BF113-1和BF43-1屬于短雙歧桿菌（B. breve），菌株MF98-1、BF88-5、MF80-22和MF96-12屬于假小鏈雙歧桿菌（B. pseudocatenulatum），菌株MF49-14、BF52-1和BF87-12屬于兩歧雙歧桿菌（B. bifidum）。

BLAST比對(duì)的親緣標(biāo)準(zhǔn)菌株和樣品來(lái)源如表2所示，與之前相同序列比較，共得到52 株腸道來(lái)源的雙歧桿菌，14 株B. pseudocatenulatum，8 株B. pseudolongum，9 株B. bifidum，7 株B. breve，5 株B. longumsubsp.infantis，6 株B. animalsubsp. lactis和3 株B. longum。

圖 2 菌株16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic tree of strains based on 16S rRNA gene sequences

表 2 NCBI BLAST比對(duì)結(jié)果Table 2 Results of alignment based on NCBI BLAST

2.2 產(chǎn)EPS的雙歧桿菌篩選

52 株雙歧桿菌經(jīng)過(guò)初篩，發(fā)現(xiàn)有11 株雙歧桿菌（B. longumMFX-1、MFX-2和MFX-3，B. longumsubsp.infantisBF66-16、BF85-15、BF85-36和BF107-4，B. bifidumBF107-7、BF52-1，B. breveMF29-2、MF29-26）在MRS平板和脫脂乳培養(yǎng)基中有產(chǎn)黏拉絲的情況，圖3為產(chǎn)糖與不產(chǎn)糖的菌株表型對(duì)比。通過(guò)苯酚-硫酸法對(duì)11 株雙歧桿菌進(jìn)行了復(fù)篩，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示有7 株雙歧桿菌的EPS含量較高（圖4），可以看出，所測(cè)7 株菌EPS產(chǎn)量均達(dá)到400 mg/L以上，尤其是來(lái)源于嬰兒糞便的B. longumsubsp. infantisBF66-16 EPS產(chǎn)量高達(dá)513.06 mg/L，具備工業(yè)生產(chǎn)的可能。

圖 3 產(chǎn)糖與不產(chǎn)糖的菌株表型對(duì)比圖Fig. 3 Phenotypic comparison between EPS-producing and non-EPS-producing strains

圖 4 菌株EPS產(chǎn)量Fig. 4 EPS yields of selected strains

2.3 雙歧桿菌粗多糖的體外抗氧化分析

圖 5 菌株抗氧化活性Fig. 5 Antioxidant activities of selected strains

過(guò)氧化氫自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基都屬于人體內(nèi)細(xì)胞衰老的誘導(dǎo)因子，它們能夠通過(guò)細(xì)胞膜，與大量生物活性分子發(fā)生反應(yīng)，緩慢地氧化機(jī)體，對(duì)機(jī)體造成氧化損傷[29]。如圖5所示，幾株雙歧桿菌EPS對(duì)過(guò)氧化氫自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基和DPPH自由基均有一定的清除能力，EPS質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL，7 株雙歧桿菌EPS對(duì)4 種自由基的清除率都超過(guò)了20%，表明7 株雙歧桿菌所產(chǎn)的EPS均具有一定的抗氧化活性，有作為這些自由基清除產(chǎn)品的可能。

2.4 產(chǎn)EPS雙歧桿菌的耐受性

人體胃液的pH值通常在3.0左右，受飲食及其他因素影響，胃液pH值也會(huì)在1.5～4.0之間浮動(dòng)，胃液的強(qiáng)酸性及胃蛋白酶會(huì)嚴(yán)重阻礙雙歧桿菌的轉(zhuǎn)運(yùn)，因此雙歧桿菌需要具備耐受胃液低pH值及胃蛋白酶的能力才能進(jìn)入小腸發(fā)揮作用[30]。7 株菌胃腸耐受實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6，菌株在pH值為2.0時(shí)基本無(wú)法存活。在pH值大于2.5時(shí)，7 株菌均表現(xiàn)出了一定的耐酸性，尤其菌株BF66-16在pH值為4.0時(shí)，存活率超過(guò)了80%，耐受胃液能力較強(qiáng)，具備益生菌潛質(zhì)。

圖 6 菌株耐受胃液能力Fig. 6 Abilities of selected strains to tolerate gastric juice

人體小腸是可食用益生菌發(fā)揮功效的場(chǎng)所，小腸中過(guò)高的膽鹽含量限制了益生菌的使用[31]，能夠在人體腸液中存活一定數(shù)量的的菌株才可以發(fā)揮益生作用。模擬腸液結(jié)果見(jiàn)圖7，7 株菌在模擬腸液中培養(yǎng)3 h后均能達(dá)到40%以上的存活率，其中BF66-16相比較于其他菌株存活率明顯較高，達(dá)到了61.05%，表明菌株對(duì)酸性條件和膽汁鹽環(huán)境具有很強(qiáng)的抵抗力，這可能與其高產(chǎn)EPS有關(guān)。在Yang Xin等[32]的研究中，轉(zhuǎn)錄組和生理學(xué)分析顯示EPS的產(chǎn)生使B. breveBB8的酸適應(yīng)性得到改善。B. animalissubsp. lactis在0.3%牛膽鹽存在的條件下誘導(dǎo)eps基因表達(dá)，且隨著膽汁鹽添加百分比的增加，EPS的合成量按比例增加[33]。因此雙歧桿菌合成這些聚合物可以作為保護(hù)機(jī)制，以應(yīng)對(duì)其腸道中遇到的惡劣條件。

圖 7 菌株耐受腸液能力Fig. 7 Abilities of selected strains to tolerate intestinal juice

2.5 產(chǎn)EPS雙歧桿菌的自凝聚能力

益生菌黏附于腸上皮細(xì)胞的能力在胃腸道定植中發(fā)揮著重要作用，可以防止菌株因蠕動(dòng)而減少，從而在生態(tài)系統(tǒng)中提供競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)[34]。已有研究證明，體外測(cè)量細(xì)菌的自凝聚和表面疏水性可用于初步篩選適合商業(yè)應(yīng)用的潛在黏附細(xì)菌[30]。自凝聚是同一種菌株間相互凝集形成多細(xì)胞簇的現(xiàn)象，益生菌通過(guò)自凝聚作用相互凝集到一定的數(shù)量時(shí)黏附才牢固，進(jìn)而達(dá)到菌株發(fā)揮益生功效所需要的數(shù)量。7 株產(chǎn)EPS的雙歧桿菌的自凝聚能力結(jié)果見(jiàn)表3，菌株懸液的自凝聚率隨著靜止時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，且不同的菌株間自凝聚率具有明顯的差異，其中菌株BF66-16與其他菌株相比表現(xiàn)出較好的自凝聚能力，5 h后菌株BF66-16的自凝聚率達(dá)到95.59%，有較強(qiáng)的自凝聚性。

表 3 產(chǎn)EPS菌株的自凝聚結(jié)果Table 3 Auto-aggregation ability of EPS-producing strains

2.6 產(chǎn)EPS雙歧桿菌的疏水性

表 4 產(chǎn)EPS菌株的疏水性結(jié)果Table 4 Hydrophobility of EPS-producing strains

疏水性較高的菌株，會(huì)對(duì)小腸組織產(chǎn)生較高的黏附能力[35]。由表4可以看出，所有菌株均表現(xiàn)出一定的疏水性，不同菌株的疏水性差異較大，二甲苯是一種非極性溶劑，除菌株BF107-7和BF52-1外，其余5 株菌均表現(xiàn)出對(duì)二甲苯較高的疏水性（＞40%），說(shuō)明這些菌株都具有疏水的細(xì)胞表面。氯仿是酸性溶劑，屬于電子受體，而乙酸乙酯是單堿性溶劑，屬于電子供體。7 株雙歧桿菌對(duì)氯仿的疏水性都明顯的高于對(duì)乙酸乙酯的疏水性，尤其是菌株BF52-1和BF66-16對(duì)氯仿的疏水性均大于85%，說(shuō)明這兩株雙歧桿菌都是電子供體。因此本研究通過(guò)自凝聚和疏水性篩選出的菌株BF66-16初步判斷其能夠黏附在胃腸道中，且BF66-16在模擬胃腸液中的存活能力較強(qiáng)，說(shuō)明菌株可以在胃腸液環(huán)境中以較高的數(shù)量存活下來(lái)，發(fā)揮其抗氧化活性。

3 結(jié) 論

本研究從新疆維吾爾族腸道中分離出52 株雙歧桿菌，分屬于B. pseudocatenulatum、B. bifidum、B. breve、B. pseudolongum、B. longum五個(gè)種以及B. longumsubsp.infantis、B. animalsubsp. lactis兩個(gè)亞種。對(duì)菌株產(chǎn)EPS的能力進(jìn)行初篩和復(fù)篩后，共得到7 株EPS產(chǎn)量較高的雙歧桿菌，質(zhì)量濃度均在400 mg/L以上，且所產(chǎn)的EPS具有一定的抗氧化活性，對(duì)人體健康有益。模擬胃腸液耐受性和體外黏附性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株BF66-16耐受胃腸液能力相比于其他幾株雙歧桿菌較強(qiáng)，在pH 2.0的胃液環(huán)境下，存活率仍可達(dá)3.39%，在pH 4.0時(shí)存活率為81.13%，模擬腸液中存活率達(dá)到了61.05%；同時(shí)BF66-16對(duì)氯仿和二甲苯的黏附百分比超過(guò)60%，5 h后的自凝聚率為95.59%，證明菌株能夠以較高的活菌量黏附于胃腸道中，以發(fā)揮其抗氧化活性。由此可見(jiàn)，來(lái)源于嬰兒糞便的BF66-16可以作為潛在抗氧化菌株，為后續(xù)開(kāi)發(fā)適合少數(shù)民族消費(fèi)的益生型產(chǎn)品提供新的研究思路和菌株資源。