胡小霞，黃永光,,*，蔣 想，朱家合，金 磊

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州巖博酒業(yè)有限公司，貴州 盤州 553523；3.無錫市振太酒業(yè)有限公司，江蘇 無錫 214092）

中國白酒是世界上最古老的蒸餾酒之一[1]，在其發(fā)展進(jìn)程中，基于釀酒原料、釀造工藝、自然環(huán)境、糖化發(fā)酵劑等因素的差異，逐漸形成了各具特色、風(fēng)格典型的醬香、濃香、清香等12 種香型白酒[2]。隨著消費需求發(fā)展，白酒釀造工藝和科技也隨之進(jìn)步，白酒香型不斷創(chuàng)新，清醬香型白酒正是香型創(chuàng)新的代表產(chǎn)物，目前在全國已獲得廣大消費者認(rèn)可和青睞。清醬香型人民小酒采用本地產(chǎn)糯高粱為原料，高溫水泡糧煮糧，小曲糖化培菌、大曲堆積發(fā)酵生香，陶壇發(fā)酵或窖池長期發(fā)酵，分級取酒，分類貯存，陳釀勾兌而成。其釀造工藝有機(jī)融合了清香型、醬香型白酒釀造之精華，酒體風(fēng)格“清亮透明，清醬協(xié)調(diào)，香氣幽雅，醇厚豐滿，細(xì)膩柔順，回味悠長，空杯留香”，既滿足了清香型白酒的幽雅、凈爽，又富有醬香白酒的醇厚、細(xì)膩、回味悠長風(fēng)格[3]。

眾所周知，白酒釀造的產(chǎn)質(zhì)量與釀造過程微生物菌群結(jié)構(gòu)及其代謝密不可分，清醬香型白酒風(fēng)格之所以不同于典型的清香型和醬香型白酒，除在釀造工藝上的創(chuàng)新和不同外，更根本原因在于其釀酒微生物結(jié)構(gòu)的差異和釀造環(huán)境的獨特。目前研究普遍認(rèn)為，在白酒釀造微生物體系中，細(xì)菌有產(chǎn)酶和產(chǎn)香的能力[4]，通過代謝產(chǎn)生豐富的風(fēng)味物質(zhì)決定白酒的香型和品質(zhì)[5-6]。白酒釀造過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也一直是白酒界的研究熱點[7-9]。

清醬香白酒作為創(chuàng)新香型白酒，還處于發(fā)展起步階段，釀造過程的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)體系尚不明確，這在一定程度上制約了它的發(fā)展。因此，為揭示釀酒微生態(tài)、功能微生物多樣性結(jié)構(gòu)對清醬香型人民小酒釀造及其酒體風(fēng)格影響的機(jī)理以及清醬香型白酒釀造過程中重要發(fā)酵微生物的調(diào)節(jié)機(jī)制，本研究通過高通量測序策略并結(jié)合數(shù)理統(tǒng)計系統(tǒng)，分析清醬香型白酒陶壇發(fā)酵過程中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，并進(jìn)一步研究其主要細(xì)菌群落在發(fā)酵過程中的變化規(guī)律及調(diào)控機(jī)制，以期推動清醬香型白酒的創(chuàng)新發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

樣品采集自貴州省YB酒業(yè)有限公司2 個陶壇發(fā)酵生產(chǎn)車間（分別記為YB1和YB2，其入壇發(fā)酵時間和發(fā)酵工藝一致）2018年6—7月生產(chǎn)發(fā)酵酒醅，發(fā)酵期為21 d。每個車間同一天有50 壇酒醅入壇發(fā)酵，從中隨機(jī)抽取10 壇進(jìn)行跟蹤取樣，由于陶壇質(zhì)地、糟醅入壇溫度、水分、酸度、糟醅疏松度等相關(guān)因素影響，酒醅上層、中層、下層及內(nèi)層、外層微生物分布存在一定差異，因此，每次采集酒醅上、中、下3 個發(fā)酵酒醅層次的發(fā)酵酒醅樣品，每個發(fā)酵酒醅層采集中間和邊緣位置（圖1），然后將6 個點樣品均勻混合為一個樣品以消除取樣誤差，混合后取200 g存于無菌自封袋中。再將從10 個發(fā)酵壇中采集的樣品各取20 g混合為綜合樣。每次采集酒醅樣品樣均采用專業(yè)的取樣器定時定位取樣，取樣器消毒滅菌后，瞬間打開封壇蓋膜，取樣器刺穿到糟醅層面，迅速、嚴(yán)格進(jìn)行取樣操作，因取樣器直徑很小，只會留下1 個小孔，且取樣時間很短，取樣完畢后則立即將小孔密封，封壇。根據(jù)前期基礎(chǔ)研究和生產(chǎn)實際，由于發(fā)酵10 d后，發(fā)酵進(jìn)入穩(wěn)定階段，因此取樣時間定為發(fā)酵第1、5、10、20天。綜合樣分別記為YB1的1F 1 d、1F 5 d、1F 10 d、1F 20 d和YB2的2F 1 d、2F 5 d、2F 10 d、2F 20 d。樣品采集完畢則即時進(jìn)行DNA提取。

圖 1 陶壇發(fā)酵酒醅取樣圖Fig. 1 Schematic of sampling positions of fermented grains from the pottery jar during fermentation

1.1.2 試劑

DNA Marker 寶生物工程（大連）有限公司；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、引物合成上海生物工程股份有限公司；E.Z.N.A. Soil DNA Kit美國Omega BioTek公司；異丙醇（分析純）、TAE（Tris acetate-EDTA）緩沖液 北京索萊寶科技有限公司；瓊脂糖 南京生興生物技術(shù)有限公司；Goldview染料 上海賽百盛有限公司；rTaqDNA聚合酶試劑盒北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Zealway G154DW高壓蒸汽滅菌鍋 致徽（廈門）儀器有限公司；臺式高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；GeneAmp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；DYY-8C型電泳儀北京六一儀器廠；JS-680C凝膠成像儀 上海培清科技有限公司；MiSeq測序儀 美國Illumina公司；QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng) 美國Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理[6,10-11]及DNA提取

分別取1.1.1節(jié)最后混勻的8 個綜合樣各16 g于100 mL離心管中，用30 mL滅菌后的0.1 mol/L PBS懸浮，加入3～5 顆玻璃珠，旋渦振蕩7 min，400 r/min離心5 min，取上清液。沉淀用PBS洗滌，旋渦振蕩4 min，400 r/min離心5 min，收集上清液。將沉淀用PBS洗滌，旋渦振蕩2 min，400 r/min離心5 min，收集上清液。全部上清液于12 000 r/min離心5 min，棄上清液，收集細(xì)胞沉淀。預(yù)處理結(jié)束后，根據(jù)E.Z.N.A.?soil DNA Kit的操作說明提取各樣品中的微生物總DNA。

1.3.2 16S rRNA基因擴(kuò)增及Illumina MiSeq測序

應(yīng)用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）擴(kuò)增V3和V4高變區(qū)。PCR體系及反應(yīng)條件見黃蘊利等[12]的方法；每個樣本做3 個重復(fù)。將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用1.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫；1.1%瓊脂糖電泳檢測。

參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測并定量，再按照每個樣本的測序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。連接“Y”字形接頭，使用磁珠篩選去除接頭自連片段，利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫模板富集，氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段，制備MiSeq PE文庫。再在Illumina MiSeq（PE300）平臺上機(jī)測序。

1.4 數(shù)據(jù)及圖像處理

采用Microsoft Office Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)計算，IBM SPSS Statistics進(jìn)行顯著性分析，R語言繪制氣泡圖和群落差異分析圖，Cytoscape繪制共線性網(wǎng)絡(luò)分析圖和相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 陶壇發(fā)酵過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

對兩組樣品細(xì)菌的高通量測序結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，圖2為清醬香型白酒陶壇發(fā)酵過程的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)氣泡圖。

圖 2 發(fā)酵過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性在屬水平上的分布圖（相對豐度＞1%）Fig. 2 Distribution of microbial community at the genus level(relative abundance ＞ 1%)

從YB1中檢出11 個門，從YB2中檢出9 個門，YB1和YB2酒醅樣品中共檢出Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Cyanobacteria、Deinococcus-Thermus、p_unclassified_k__norank、Fusobacteria、Saccharibacteria、Planctomycetes、Acidobacteria 11 個門，其中優(yōu)勢細(xì)菌門（平均相對豐度＞10%）為Firmicutes（67.09%）和Proteobacteria（31.42%），這與清香型[11,13]和醬香型[7,14]白酒發(fā)酵過程的優(yōu)勢細(xì)菌門一致。Firmicutes在清醬香型白酒發(fā)酵酒醅中占絕對主導(dǎo)地位，在清香型和醬香型白酒發(fā)酵酒醅中同樣如此，但豐度占比有所差異[7,11]。

從YB1中檢出166 個屬，從YB2中檢出146 個屬，YB1和YB2酒醅樣品中共檢出178 個屬。如圖2所示，有21 個屬相對豐度至少在一個樣品中超過1%，分別是：Weissella、Staphylococcus、Lactobacillus、Oceanobacillus、Bacillus、Lentibacillus、Kroppenstedtia、Pediococcus、Leuconostoc、g_unclassified_o_Bacillales、Gluconobacter、Pseudomonas、Acetobacter、Enterobacter、Komagataeibacter、Acinetobacter、Kozakia、Pantoea、Psychrobacter和g_unclassified_c_Alphaproteobacteria、Chryseobacterium。

上述21 個細(xì)菌屬中，Weissella、Leuconostoc、Lactobacillus和Pediococcus屬于乳酸菌。乳酸菌在發(fā)酵過程可通過產(chǎn)乳酸、乙酸等有機(jī)酸，直接影響酒體風(fēng)味。同時，乳酸和乙酸是白酒中重要風(fēng)味成分乳酸乙酯和乙酸乙酯的前體。乳酸菌還可通過代謝有機(jī)酸、競爭營養(yǎng)成分、產(chǎn)生抗菌素等抑制其他微生物的生長，從而調(diào)節(jié)發(fā)酵過程的微生物群落結(jié)構(gòu)，間接影響酒體的品質(zhì)。此外，乳酸菌還能為酵母發(fā)酵過程的酯化作用提供前體物質(zhì)，具有促進(jìn)釀酒發(fā)酵和美拉德反應(yīng)及維持釀酒微生態(tài)環(huán)境等作用[15-17]。Gluconobacter、Acetobacter、Komagataeibacter和Kozakia屬于醋酸菌[18]。醋酸菌是一類嚴(yán)格好氧的革蘭氏陰性細(xì)菌，能氧化葡萄糖或乙醇生成乙酸，是乙酸代謝的主要來源。乙酸是白酒中主要風(fēng)味成分之一。少量的乙酸對改善白酒風(fēng)味、促進(jìn)酒體清香有重要作用[6]。Weissella和Leuconostoc可啟動發(fā)酵，Leuconostoc還可利用葡萄糖進(jìn)行異型乳酸發(fā)酵產(chǎn)生D-型乳酸和乙酸[19]。Gluconobacter能產(chǎn)生乙酸[20]。Acetobacter能產(chǎn)細(xì)菌纖維素[21]，具有氧化乙醇生成乙酸并進(jìn)一步氧化乙酸的能力[22]。Fan Guangsen等[20]在清香型大曲中檢測到一種Acetobacter orientalis，該細(xì)菌將葡萄糖發(fā)酵成乙醇，將乙醇轉(zhuǎn)化成乙酸，通過生產(chǎn)乙酸異戊酯和2-苯基乙酸乙酯等酯類對酒體風(fēng)味有積極作用。Komagataeibacter的部分菌株可產(chǎn)生細(xì)胞纖維素，可以由甘油產(chǎn)生二羥基丙酮，可以氧化葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、乙醇產(chǎn)生有機(jī)酸等[22]，Komagataeibacter在葡萄酒和有機(jī)蘋果酒浸泡醋生產(chǎn)中，被確定為葡萄酒醋和蘋果醋發(fā)酵中的主要微生物[23]，但尚未在白酒發(fā)酵中見到報道。Kozakia能利用蔗糖或D-果糖生產(chǎn)類似果聚糖的黏性物質(zhì)，也能氧化乙酸鹽和乳酸鹽，利用乙醇生產(chǎn)食醋[18]。Oceanobacillus是大曲中的主要微生物[24]，具有產(chǎn)乳酸的功能[25]。Bacillus是醬香型白酒生產(chǎn)中的主要功能菌，能在55 ℃及以上高溫下生長，促進(jìn)以葡萄糖、甘氨酸和氯化鈉為原料的美拉德反應(yīng)迅速發(fā)生，生成乙酸、乙酸乙酯、乙醛、乙縮醛、丁二醇等風(fēng)味物質(zhì)，是重要的產(chǎn)酸和產(chǎn)香菌，促進(jìn)濃郁的醬香風(fēng)味形成；并且Bacillus還能代謝酶水解淀粉、蛋白質(zhì)等，產(chǎn)生丁酸和己酸等，還有助于雙乙酰等芳香物質(zhì)和吡嗪、醛類、酮類、醇類等揮發(fā)性化合物形成[6]。Enterobacter存在于大曲和小曲中[26]。Wang Peng等[27]發(fā)現(xiàn)在大曲發(fā)酵8 d后，Enterobacter便成為優(yōu)勢微生物。黃瑩娜等[28]認(rèn)為Enterobacter是白云邊窖泥中特有的優(yōu)勢菌屬，對其濃醬兼香風(fēng)格的形成有重要貢獻(xiàn)。且Enterobacter中的某些菌可產(chǎn)纖維素酶和乳酸[29-31]。Acinetobacter是具有呼吸和發(fā)酵代謝作用的細(xì)菌[31]，以葡萄糖和其他碳水化合物代謝產(chǎn)酸，是醬香型[31]和清香型[32]白酒酒醅中的主要微生物。酸類物質(zhì)具有平衡酒味、協(xié)調(diào)香氣的作用。同時酸類物質(zhì)也是形成酯類化合物的前體物質(zhì)，而酯類化合物是構(gòu)成清醬香型人民小酒揮發(fā)性香氣的重要物質(zhì)[3]。綜上表明，上述微生物具有促進(jìn)清醬香白酒風(fēng)味物質(zhì)富集的作用。

Pseudomonas是清香型白酒酒醅中的主要微生物[28]。Liu Xiu等[33]在大曲發(fā)酵的風(fēng)干階段檢測到Pseudomonas。Staphylococcus為醬香型酒曲和部分堆積前、中期酒醅中的優(yōu)勢菌群，文獻(xiàn)報道[17]部分Staphylococcus在香腸、火腿等發(fā)酵食品生產(chǎn)過程可產(chǎn)生獨特的風(fēng)味物質(zhì)。Pantoea、Kroppenstedtia和Lentibacillus都是大曲中的主要微生物[26,34]。清醬香型白酒采用大小曲共同發(fā)酵，發(fā)酵工藝和酒體風(fēng)格融合了清、醬香型白酒二者之優(yōu)勢。因此，清香型或醬香型白酒發(fā)酵過程中的主要微生物，如果在清醬香型白酒中的相對豐度較高（相對豐度＞1%），對清醬香型白酒發(fā)酵也有一定影響作用。

高通量測序結(jié)果表明，Weissella、Gluconobacter、Lactobacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Acetobacter、Bacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus、Lentibacillus、Pediococcus、Enterobacter和Komagataeibacter在酒醅中的平均相對豐度大于1%，Acinetobacter、Leuconostoc、Kozakia和Pantoea在發(fā)酵結(jié)束階段平均相對豐度大于1%。以上微生物在清醬香型白酒陶壇發(fā)酵過程中的相對豐度及其功能作用表明，Weissella、Gluconobacter、Lactobacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Acetobcter、Bacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus、Lentibacillus、Pediococcus、Enterobacter、Komagataeibacter、Acinetobacter、Leuconostoc、Kozakia和Pantoea共17 種屬是清醬香型白酒發(fā)酵過程的主要細(xì)菌屬。其中優(yōu)勢細(xì)菌屬（平均相對豐度＞10%）為Weissella（20.61%）、Staphylococcus（14.19%）、Lactobacillus（12.08%）和Gluconobacter（14.17%）。而前人研究表明，清香型白酒中的主要細(xì)菌屬是Lactobacillus、Streptpcoccus、Pediococcus、Aerococcus、Bacillus、Acetobacter、Pseudomonas、Kroppenstedtia、Weissella、Acinetobacter和Leuconostoc[6,11,32,35]。如圖3所示，Weissella、Lactobacillu、Pseudomonas、Acetobacter、Bacillus、Kroppenstedtia、Pediococcus、Acinetobacter和Leuconostoc是清香型和清醬香型白酒酒醅共有的主要細(xì)菌屬，Streptpcoccus和Aerococcus在清香型白酒釀造中是主要細(xì)菌屬，但Streptpcoccus在清醬香型白酒發(fā)酵過程中未檢出，Aerococcus在清醬香型白酒發(fā)酵過程中含量很低（在各樣品中相對豐度均低于0.01%）。醬香型白酒酒醅中的主要細(xì)菌屬為Acidithiobacillus、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Acetobacter、Pediococcus、Bacillus、Pantoea、Weissella、Thermoactinomyces、Enterobacter、Pseudomonas、Stenotrophomonas、Phyllobacterium、Shewanella、Chryseobacterium、Escherichia-Shigella、Clostridium、Sensu stricto1、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium、Peptoclostridium、Citrobacter、Acinetobacter、Lactococcus、Staphylococcus、Enhydrobacter、Burkholderia、Desmospor[10,14,31,36-37]。其中Weissella、Lactobacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Acetobacter、Bacillus、Kroppenstedtia、Pediococcus、Enterobacter、Acinetobacter、Pantoe是醬香型和清醬香型白酒酒醅共有的主要細(xì)菌屬，Acidithiobacillus、Thermoactinomyces、Stenotrophomonas、Phyllobacterium、Shewanella、Chryseobacterium、Escherichia-Shigella、Clostridium、Sensu stricto1、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium、Peptoclostridium、Citrobacter、Lactococcus、Enhydrobacter、Burkholderia、Desmospora、Serpens是醬香型白酒酒醅中的主要細(xì)菌屬，但Acidithiobacillus、Phyllobacterium、Shewanella、Clostridium、Sensu stricto1、Actinobacillus、Peptoclostridium、Citrobacter、Burkholderia、Desmospora和Serpens在清醬香型白酒發(fā)酵過程中未檢出，Thermoactinomyces、Stenotrophomonas、Chryseobacterium、Escherichia-Shigella、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium、Lactococcus和Enhydrobacter在清醬香型白酒發(fā)酵過程中含量很低（在各樣品中平均相對豐度介于0%～0.35%）。與清香型和醬香型白酒相比，Gluconobacter、Oceanobacillus、Lentibacillus、Komagataeibacter、Kozakia是清醬香型白酒酒醅中特有的主要細(xì)菌屬。正是由于發(fā)酵菌群結(jié)構(gòu)的差異，其發(fā)酵動力和風(fēng)味動力上也會存在差異，從而導(dǎo)致了醬香、清香、清醬香白酒發(fā)酵產(chǎn)率及其酒體風(fēng)格特征上的差異。

圖 3 不同香型白酒主要細(xì)菌屬水平分布Venn圖Fig. 3 Venn map of main bacterial genera in Chinese liquors of different flavors

上述結(jié)果表明，在門水平，清醬香、清香、醬香型白酒釀造微生物差異不大，都是Firmicutes和Proteobacteria為優(yōu)勢細(xì)菌門，且Firmicutes占主導(dǎo)地位。在屬水平，清醬香型白酒釀造過程主要細(xì)菌屬與清香型、醬香型白酒堆積發(fā)酵過程的主要細(xì)菌屬有很大重合，但又有各自特有的主要細(xì)菌屬。說明清醬香型白酒釀造過程的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與清香型白酒、醬香型白酒釀造均有一定的相似性，但又不同于清香型白酒和醬香型白酒釀造細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，具有其自身獨特性。清醬香型白酒釀造過程的主要細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)兼具了清香和醬香白酒釀造主要細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)特點。

2.2 發(fā)酵起始和結(jié)束階段細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

2.2.1 發(fā)酵起始和結(jié)束階段酒醅樣品與物種共線性分析

為獲得細(xì)菌在發(fā)酵起始和結(jié)束階段的表型差異和共存在關(guān)系，必須對清醬香型白酒陶壇發(fā)酵過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，進(jìn)一步認(rèn)識其調(diào)控作用，對兩車間發(fā)酵1 d和發(fā)酵20 d酒醅樣品的細(xì)菌進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見圖4。

圖 4 發(fā)酵1 d和20 d酒醅樣品與物種共線性網(wǎng)絡(luò)分析圖Fig. 4 Collinearity analysis of bacterial genera in 1 d and 20 d fermented grains

對比YB1發(fā)酵起始（1F 1 d）和發(fā)酵結(jié)束（1F 20 d）時的酒醅，從圖4a可看出，有Candidatus_Saccharimonas等6 個屬只出現(xiàn)在發(fā)酵1 d酒醅中，發(fā)酵結(jié)束時未檢出，說明這6 個屬受發(fā)酵條件調(diào)控明顯。這6 個屬在發(fā)酵1 d時相對豐度和占0.03%，在發(fā)酵過程所占菌群結(jié)構(gòu)比例很小。此外，有56 個屬在發(fā)酵1 d未檢出，但在發(fā)酵結(jié)束階段檢出（相對豐度和占0.48%），這些屬與發(fā)酵工藝變化存在協(xié)同性，并富集于發(fā)酵過程。值得注意的是，有79 個屬同時出現(xiàn)在發(fā)酵開始和結(jié)束階段，其中有73 個屬同時出現(xiàn)在YB1的4 個采樣階段，在各階段的豐度和分別占99.96%、98.91%、99.38%和98.05%，表明這些屬在發(fā)酵過程起主導(dǎo)性作用。對比YB2酒醅在發(fā)酵開始（2F 1 d）和發(fā)酵結(jié)束（2F 20 d）階段的菌群結(jié)構(gòu)（圖4b）可知，有26 個屬只出現(xiàn)在發(fā)酵1 d，發(fā)酵結(jié)束時未檢出，這部分屬在發(fā)酵1 d的相對豐度和占0.20%。此外，有33 個屬在于發(fā)酵1 d未檢出，但在發(fā)酵結(jié)束時有檢出，其相對豐度和占0.20%。同時出現(xiàn)在發(fā)酵開始和結(jié)束階段的有79 個屬，其中有66 個屬同時出現(xiàn)在YB2樣品的4 個采樣階段，這66 個屬在各階段的豐度和分別占99.68%、99.54%、99.60%和97.83%，同樣表明這些屬在發(fā)酵過程具有重要作用。

在YB1酒醅樣品中，共檢出166 個屬，有43.96%的屬存在于發(fā)酵起始階段并穩(wěn)定遷移、維持至發(fā)酵結(jié)束階段，這些屬在各階段的相對豐度和高達(dá)98%以上。另外，有33.73%的屬在發(fā)酵起始階段未檢出，在發(fā)酵進(jìn)程中富集，但在發(fā)酵結(jié)束時相對豐度和僅占0.48%。在YB2酒醅中共檢出146 個屬，有45.21%的屬從發(fā)酵起始階段一直穩(wěn)定至發(fā)酵結(jié)束，其在各階段的相對豐度和高達(dá)97.83%以上。另外，有22.60%的屬在發(fā)酵起始階段未檢出，但在發(fā)酵過程得到富集，到發(fā)酵結(jié)束時相對豐度和為0.20%。上述結(jié)果表明，在清醬香型白酒（人民小酒）發(fā)酵過程中，YB1、YB2平均有10.71%的細(xì)菌發(fā)生消亡，同時平均有28.17%的新物種得到富集，但其相對豐度和均不超過1.9%，所起的調(diào)控和發(fā)酵作用不明顯，起主導(dǎo)作用的微生物菌群從發(fā)酵起始階段就存在并穩(wěn)定維持至發(fā)酵結(jié)束。雖然兩個車間的微生物存在一定差異，但調(diào)控發(fā)酵的主要微生物結(jié)構(gòu)相似度高，且穩(wěn)定性較好，部分微生物存在差異主要來源于隨發(fā)酵時間延長，發(fā)酵工藝參數(shù)變化和微生物結(jié)構(gòu)變化之間的相互影響和調(diào)控。

2.2.2 發(fā)酵起始和結(jié)束階段主要細(xì)菌群落差異分析

根據(jù)上述主要細(xì)菌菌群豐度數(shù)據(jù)，運用統(tǒng)計學(xué)方法，對發(fā)酵1 d和發(fā)酵20 d酒醅的主要細(xì)菌屬進(jìn)行假設(shè)檢驗，評估物種豐度差異的顯著性水平，獲得發(fā)酵起始和結(jié)束階段樣品的顯著性差異物種及主要細(xì)菌屬變化結(jié)果，以進(jìn)一步解析發(fā)酵過程主要細(xì)菌屬的調(diào)控作用，結(jié)果如圖5所示。

上述17 個主要細(xì)菌屬，在YB1（圖5a）中相對豐度高度顯著（P＜0.001）下降的有Weissella、Gluconobacter和Pseudomonas3 個屬，其余14 個屬全部呈高度顯著（P＜0.001）上升。在YB2（圖5b）中相對豐度下降的有Weissella、Gluconobacter、Staphylococcus、Bacillus和Lentibacillus5 個屬，其余12 個屬相對豐度呈現(xiàn)上升。其中，Weissella、Gluconobacter、Staphylococcus和Lentibacillus4 個屬相對豐度呈現(xiàn)高度顯著（P＜0.001）下降，Lactobacillus、Pseudomonas、Acetobacter、Oceanobacillus、Kroppenstedtia、Pediococcus、Enterobacter、Komagataeibacter、Acinetobacter、Leuconostoc和Pantoea11 個屬相對豐度呈現(xiàn)高度顯著（P＜0.001）上升，Bacillus和Kozakia無顯著性變化（P＞0.01）。

圖 5 發(fā)酵起始和結(jié)束階段主要細(xì)菌群落差異分析Fig. 5 Analysis of differences in major bacterial community at the initial and final stages of fermentation

同時也可看出，在發(fā)酵階段，主要細(xì)菌屬的相對豐度存在變化。兩個車間平均73.53%的主要細(xì)菌屬呈現(xiàn)高度顯著（P＜0.001）上升，平均20.59%的主要細(xì)菌屬呈現(xiàn)高度顯著（P＜0.001）下降，僅有2 個屬無顯著性變化。發(fā)酵結(jié)束階段，細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)相對比較穩(wěn)定，沒有占絕對優(yōu)勢的微生物。在YB1中僅有Gluconobacter和Staphylococcus兩個屬是優(yōu)勢細(xì)菌屬，相對豐度分別是18.20%和20.46%；在YB2也只有Weissella和Lactobacillus兩個屬是優(yōu)勢細(xì)菌屬，相對豐度分別為12.03%和25.97%。

綜上，發(fā)酵階段會發(fā)生主要細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的內(nèi)部調(diào)控機(jī)制，平均73.53%的主要細(xì)菌屬相對豐度呈高度顯著（P＜0.001）上升，20.59%的主要細(xì)菌屬相對豐度呈高度顯著（P＜0.001）下降。細(xì)菌在發(fā)酵過程的含量變化主要受發(fā)酵過程發(fā)酵酒醅理化指標(biāo)變化和微生物群落結(jié)構(gòu)的雙向調(diào)控。到發(fā)酵結(jié)束階段，因酒醅理化指標(biāo)所導(dǎo)致的發(fā)酵環(huán)境相對穩(wěn)定，所以該階段的主要細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)相對穩(wěn)定，其相對豐度均小于25.97%。

2.3 主要細(xì)菌群落之間相關(guān)性

上述結(jié)果表明發(fā)酵過程的主要細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)之間通過共生、競爭及拮抗等關(guān)系形成復(fù)雜的相互調(diào)控機(jī)制，進(jìn)而形成一個相對穩(wěn)定的發(fā)酵微生物群落。為深入挖掘主要細(xì)菌群落之間的相關(guān)性及其變化規(guī)律，采用網(wǎng)絡(luò)分析方法對17 個主要細(xì)菌屬進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果如圖6所示。

圖 6 酒醅樣品中的主要細(xì)菌群落相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖（屬水平）Fig. 6 Correlation network of major bacterial genera in fermented grain samples

從圖6可看出，發(fā)酵過程平均81.12%的細(xì)菌菌屬之間呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。在YB1中，正相關(guān)性占總相關(guān)性的85.19%，負(fù)相關(guān)性占總相關(guān)性的14.81%。在YB2中，正相關(guān)性占總相關(guān)性的77.05%，負(fù)相關(guān)性占總相關(guān)性的22.95%。表明這些微生物菌群在發(fā)酵過程存在一定程度上相似生態(tài)位。

Hubs種類及多少在一定程度上可反映特定環(huán)境中微生物菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。從YB1的同現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)圖譜（圖6a）中共發(fā)現(xiàn)Komagataeibacter、Pantoea、Lentibacillus、Enterobacter、Oceanobacillus、Pediococcus、Staphylococcus和Bacillus8 個Hubs（這里指至少與其他4 個屬的微生物存在正相關(guān)的節(jié)點）。Komagataeibacter是Proteobacteria門下的醋酸菌，與Bacillus、Kozakia、Acetobacter、Pantoea、Pediococcus和Enterobacter顯著正相關(guān)（P＜0.05）。Pantoea與Leuconostoc顯著正相關(guān)（P＜0.05）。Lentibacillus與Oceanobacillus、Staphylococcus和Kroppenstedtia顯著正相關(guān)（P＜0.05）。Bacillus與Pantoea顯著正相關(guān)（P＜0.05）。Staphylococcus與Oceanobacillu和Kroppenstedtia顯著正相關(guān)（P＜0.05）。Pediococcus與Bacillus、Leuconostoc和Pantoea顯著正相關(guān)（P＜0.05）。Lentibacillus與Oceanobacillu、Staphylococcus和Kroppenstedtia顯著正相關(guān)（P＜0.05）。Enterobacter與Bacillus、Staphylococcus、Oceanobacillu和Lentibacillus顯著正相關(guān)（P＜0.05）。從YB1的負(fù)相關(guān)網(wǎng)絡(luò)（圖6b）可發(fā)現(xiàn)Pseudomonas1 個負(fù)相關(guān)Hub（這里指至少與其他3 個屬的微生物存在負(fù)相關(guān)的節(jié)點）。Pseudomonas與Gluconobacter、Acetobacter和Kozakia顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），此外乳酸菌Weissella和醋酸菌Acinetobacter顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

從YB2的共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)圖譜（圖6c）中共發(fā)現(xiàn)10 個Hubs，分別是Firmicutes下的Pediococcus、Lactobacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus和Leuconostoc；Proteobacteria下的Komagataeibacter、Acetobacter、Enterobacter、Acinetobacter和Pantoea。這些微生物中，除Leuconostoc與Acinetobacter，Kroppenstedtia與Oceanobacillus、Pediococcus之間相關(guān)性不顯著外（P＞0.05），其余全部兩兩顯著正相關(guān)（P＜0.05）。從YB2的負(fù)相關(guān)網(wǎng)絡(luò)（圖6d）發(fā)現(xiàn)Staphylococcus和Pseudomonas兩個Hubs。Staphylococcus與Acetobacter、Leuconostoc、Pantoea、Enterobacter、Komagataeibacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus和Acinetobacter顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），這幾個微生物屬全都是正相關(guān)Hubs。而在YB1中，Staphylococcus與Lentibacillus、Enterobacter、Oceanobacillus和Kroppenstedtia顯著正相關(guān)（P＜0.05）。該結(jié)果與Staphylococcus在兩個車間的含量不同有關(guān)。在YB1中，Staphylococcus總體呈上升趨勢，相對豐度從起發(fā)階段的9.07%上升至發(fā)酵結(jié)束時的20.46%。而在YB2，Staphylococcus的相對豐度從起酵時的28.03%下降至發(fā)酵結(jié)束時為0.95%。在YB2中，Pseudomonas和Lentibacillus、Bacillus、Kozakia顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），Pseudomonas在YB1中也與3 個屬的微生物存在顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

從主要細(xì)菌群落在兩個車間酒醅的相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其發(fā)酵過程平均81.12%的主要細(xì)菌菌屬之間呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），18.88%的主要細(xì)菌菌屬之間呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。Komagataeibacter、Pantoea、Enterobacter、Oceanobacillus和Pediococcus是清醬香型白酒（人民小酒）兩個車間發(fā)酵體系中共有的正相關(guān)Hubs，對維持發(fā)酵體系的正常、穩(wěn)態(tài)發(fā)展和酒體風(fēng)味的形成起到非常重要的作用。Pseudomonas是兩個車間發(fā)酵體系中共有的負(fù)相關(guān)Hub。

3 結(jié) 論

清醬香型白酒發(fā)酵過程的優(yōu)勢細(xì)菌門與清香型、醬香型白酒相同，均為Firmicutes和Proteobacteria，主要細(xì)菌屬為Weissella、Gluconobacter、Lactobacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Acetobacter、Bacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus、Lentibacillus、Pediococcus、Enterobacter、Komagataeibacter、Acinetobacter、Leuconostoc、Kozakia和Pantoea，優(yōu)勢細(xì)菌屬為Weissella、Staphylococcus、Lactobacillus和Gluconobacter。Streptpcoccus在清香型白酒釀造過程中是主要細(xì)菌屬，Acidithiobacillus、Phyllobacterium、Shewanella、Clostridium、Sensu stricto1、Actinobacillus、Peptoclostridium、Citrobacter、Burkholderia、Desmospora和Serpens在醬香型白酒酒醅中是主要細(xì)菌屬，但在清醬香型白酒發(fā)酵過程中均未檢出。與清香型、醬香型白酒釀造過程微生物對比，清醬香型白酒釀造過程的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與清香型白酒、醬香型白酒釀造均有一定的相似性，但又不同于典型的清香型和醬香型白酒釀造過程的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，具有其自身獨特性，本研究對清醬香型白酒釀造微生物群落結(jié)構(gòu)差異分析，為探究清醬香型白酒風(fēng)味形成的微生物成因（菌系基礎(chǔ)）和風(fēng)味特征凝練和品質(zhì)創(chuàng)新奠定了必要基礎(chǔ)。

發(fā)酵過程平均有10.71%的細(xì)菌發(fā)生消亡，平均28.17%的物種得到富集，但其相對豐度都很低，相對豐度和均小于1.9%；主要細(xì)菌屬的群落組成結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，平均73.53%的主要細(xì)菌屬呈高度顯著上升，20.59%的菌屬呈高度顯著下降。在發(fā)酵結(jié)束階段，主要細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，相對豐度均不超過25.97%；發(fā)酵過程，平均81.12%的主要細(xì)菌菌屬之間呈顯著正相關(guān)，18.88%的主要細(xì)菌菌屬之間呈顯著負(fù)相關(guān)。Komagataeibacter、Pantoea、Enterobacter、Oceanobacillus和Pediococcus是清醬香型白酒（人民小酒）發(fā)酵體系中共有的正相關(guān)Hubs，對維持清醬香白酒發(fā)酵體系的正常、穩(wěn)態(tài)發(fā)展和酒體風(fēng)味的形成起了非常重要的作用。