夏偉榮，李 瑩，柴 智，陳小娥，周劍忠，馮 進(jìn)，方旭波,

（1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山 316022；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014）

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽丙氨酸-組氨酸-亮氨酸-亮氨酸（Ala-His-Leu-Leu，AHLL）是從泥鰍蛋白酶解物中分離純化的一種具備抑制ACE活性的四肽。泥鰍經(jīng)蛋白酶可控降解，釋放出優(yōu)異的ACE活性肽[1]。有研究[2-3]表明它可以抑制ACE活性，在原發(fā)性高血壓大鼠上具有一定降血壓效果，通過(guò)Caco-2細(xì)胞模型研究發(fā)現(xiàn)AHLL具有較好的吸收性，細(xì)胞吸收的表觀滲透系數(shù)達(dá)到1×10-6cm/s數(shù)量級(jí)。然而，AHLL穩(wěn)定性較差，容易被消化道中蛋白酶降解，導(dǎo)致ACE抑制活性顯著下降[4]，從而減少了活性肽AHLL有效進(jìn)入吸收系統(tǒng)的量。

鐵蛋白是一類鐵貯藏蛋白質(zhì)，廣泛存在于動(dòng)植物以及微生物體內(nèi)，具有調(diào)節(jié)各類生物體內(nèi)鐵代謝平衡、抗氧化及解毒等作用[5]。生物體內(nèi)鐵蛋白主要由蛋白質(zhì)外殼和化合態(tài)鐵核兩部分組成[6]。鐵蛋白的鐵核可以通過(guò)在無(wú)氧條件下加入還原劑透析的方式除去[7]。含有鐵核的鐵蛋白稱為含鐵鐵蛋白，不含礦化鐵核的鐵蛋白稱為脫鐵鐵蛋白。近年來(lái)鐵蛋白的可逆組裝特性受到廣泛關(guān)注[8-10]。脫鐵或重組鐵蛋白在變性條件下（極酸或極堿性環(huán)境）解離為單亞基，當(dāng)pH值恢復(fù)至中性時(shí)，鐵蛋白會(huì)恢復(fù)球形結(jié)構(gòu)[11]。利用這一性質(zhì)，將鐵蛋白外殼作為納米載體，在鐵蛋白的變性復(fù)性過(guò)程中添加小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包埋于鐵蛋白的空腔內(nèi)，可使小分子物質(zhì)免受外界干擾，從而提高其穩(wěn)定性[12]。

作為首個(gè)被分離并獲得結(jié)晶的鐵蛋白，馬脾鐵蛋白備受關(guān)注，其在醫(yī)藥新材料、免疫電子顯微鏡分析技術(shù)、疾病診斷等多領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用[13]。馬脾鐵蛋白單獨(dú)作納米顆粒載體時(shí)，往往存在穩(wěn)定性差、體系易受環(huán)境因素影響的缺陷。多糖作為另一類常見(jiàn)的生物高聚物，易與蛋白質(zhì)發(fā)生復(fù)凝聚[14]，從而用其復(fù)配應(yīng)用在納米顆粒載體的材料領(lǐng)域。海藻酸鈉（sodium alginate，SA）作為天然高分子聚合物，具有生物相容性良好、可在體內(nèi)降解、毒性低、來(lái)源廣泛、價(jià)格便宜的優(yōu)勢(shì)，因此受到越來(lái)越多地關(guān)注[15]。研究表明，SA具有增稠性、凝膠性、成膜性等一系列優(yōu)良的理化性質(zhì)及生理活性，形成的納米顆粒往往具有良好的球形外觀和控釋功能[14]。已有研究表明將此兩種物質(zhì)結(jié)合運(yùn)用，既可發(fā)揮鐵蛋白可逆組裝特性又兼具多糖的控釋效果[16]。本實(shí)驗(yàn)以馬脾脫鐵鐵蛋白（horse spleen apoferritin，HSF）及SA為載體材料包埋ACE抑制肽AHLL，利用鐵蛋白和多糖的相互作用，制備均勻分散的HSF-ACE抑制肽（HSFAHLL）及HSF-SA-ACE抑制肽（HSF-SA-AHLL）納米復(fù)合體系，以期提高AHLL在消化系統(tǒng)中的吸收效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ACE抑制肽AHLL（純度＞99%，摩爾質(zhì)量452 g/mol）上海強(qiáng)耀生物科技有限公司；馬脾鐵蛋白（摩爾質(zhì)量443 kg/mol）、SA、醋酸鈉、連二亞硫酸鈉美國(guó)Sigma Aldrich公司；MOPS緩沖液 美國(guó)Amresco公司；27 MM透析袋（截留分子質(zhì)量12 000～14 000 Da） 美國(guó)Biosharp公司；乙腈（色譜純）江蘇漢邦公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）上海源葉生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基（4.5 g/LD-葡萄糖）、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、Hank’s平衡鹽溶液（Hank’s balanced salt solution，HBSS） 美國(guó)Gibco公司。其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；JB-10雷磁攪拌器、ZD-2雷磁自動(dòng)電位滴定儀上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；KQ-400KDB型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；ZNCL-GS數(shù)顯加熱磁力攪拌器 上海越眾儀器有限公司；HT7700透射電子顯微鏡 日本Hitachi公司；Malvern Nano ZS90粒度電位儀 英國(guó)Malvern儀器公司；1260 Infinity高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀美國(guó)Agilent公司；500型精密電子天平 意大利BEL公司；DK-8D電子恒溫水浴槽 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Synergy UV超純水儀 廣州東銳科技有限公司；Millicell ERS-2電阻儀 美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品溶液的制備

1.3.1.1 HSF溶液的制備

按照柴智[14]的方法制備。調(diào)節(jié)醋酸鈉緩沖溶液的pH值為5.2，用3 g/100 mL的連二亞硫酸鈉將鐵蛋白中三價(jià)鐵離子還原為二價(jià)鐵離子，透析除去。再加入1 mmol/L的2,2-聯(lián)吡啶螯合以除去痕量的鐵，最后，在pH 7.0的50 mmol/L MOPS緩沖液中透析除去2,2-聯(lián)吡啶，樣品溶解在5 mmol/L MOPS緩沖溶液中備用。用BCA試劑盒（微量酶標(biāo)法）測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)純化過(guò)程中除特殊指出，其他步驟均在4 ℃低溫操作。

1.3.1.2 多糖溶液的制備

稱取一定量的SA溶于去離子水中，25 ℃攪拌24 h使其充分水合備用。

1.3.2 HSF-AHLL的制備

準(zhǔn)確稱取20 mg的AHLL標(biāo)準(zhǔn)品，溶解在HBSS平衡鹽溶液中制備成質(zhì)量濃度為20 mg/mL的母液，4 ℃避光保存待用。將2 mL 2 μmol/L的蛋白溶液（5 mmol/L MOPS，pH 7.0）置于瓶中，用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至2.0，室溫?cái)嚢?0 min，使蛋白解離為單個(gè)亞基狀態(tài)。隨后邊攪拌邊逐滴緩慢加入20 μL AHLL母液（20 mg/mL），使其終質(zhì)量濃度為200 μg/mL，此時(shí)蛋白和AHLL的物質(zhì)的量比為1∶200。室溫?cái)嚢?0 min后，用1 mol/L NaOH將溶液pH值調(diào)至7.4，于4 ℃層析冷柜中攪拌2 h以上。再將上述混合液裝入截留分子質(zhì)量為12 000～14 000 Da的透析袋，在pH 7.4、5 mmol/L MOPS溶液里進(jìn)行透析處理，除去未包埋的游離AHLL，每隔8 h換一次透析液，待透析完成后取出包埋物備用。

1.3.3 HSF-SA-AHLL的制備

調(diào)節(jié)SA溶液的終質(zhì)量濃度為5～25 mg/L。分別調(diào)節(jié)HSF-AHLL納米顆粒懸浮液和SA溶液的pH值至3.0[14]，然后將SA溶液逐滴滴入納米顆粒懸浮液中，同時(shí)不斷攪拌獲得HSF-SA-AHLL復(fù)合納米運(yùn)載體系。然后，將包埋物置于截留分子質(zhì)量為12 000～14 000 Da的透析袋中，使用MOPS緩沖液（pH 7.0，5 mmol/L）在4 ℃層析柜中避光透析4 次，每隔8 h換一次透析緩沖液，以除去未結(jié)合的AHLL，獲得HSF-SA-AHLL包埋物，置于4 ℃避光保存。

1.3.4 納米粒粒徑和Zeta電位的測(cè)定

將按1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)制備的納米粒放入Malvern Nano ZS90粒度電位儀的槽中[17]，散射光角度固定在90°，測(cè)定溫度固定在（25±1）℃。儀器所用光源是固定激光，操作波長(zhǎng)為353 nm，功率為30 W，測(cè)定納米粒的粒徑和Zeta電位。

1.3.5 納米粒中AHLL含量的測(cè)定

采用HPLC方法測(cè)定載入納米粒中AHLL的含量。將制備好的HSF-AHLL或HSF-SA-AHLL納米粒溶液在10 000 r/min離心2 min，取上清液，用0.22 μm的水系膜過(guò)濾，進(jìn)行HPLC定量。

色譜條件[18]：C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，2 μm）；樣品采用梯度洗脫，流動(dòng)相A為超純水（含體積分?jǐn)?shù)0.1%的三氟乙酸），流動(dòng)相B為乙腈（含體積分?jǐn)?shù)0.1%的三氟乙酸）；程序?yàn)?1 min內(nèi)流動(dòng)相B為15%～40%；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，流速1 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL，程序時(shí)間15 min。用純度為99%的AHLL標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中AHLL的含量，每個(gè)樣品至少做3 組平行，取平均值。

1.3.6 納米粒對(duì)AHLL包封率的測(cè)定

納米粒中樣品包封率是指被載入納米粒中的樣品量占投入體系樣品總量之比。用HPLC方法檢測(cè)體系中游離的AHLL含量，包封率計(jì)算見(jiàn)式（1）：

式中：A1為投入的AHLL總含量；A2為游離的AHLL含量。

1.3.7 透射電子顯微鏡分析[19]

用移液槍吸取制備好的納米粒，懸滴到帶有支持膜的銅網(wǎng)上，室溫靜置2 min后用濾紙從液珠邊緣吸去多余液體，稍晾干后用2%的磷鎢酸溶液負(fù)染30 s，而后用濾紙吸去染液，靜置待液體揮發(fā)干凈后放入樣品槽觀察。

1.3.8 包埋肽在Caco-2細(xì)胞單層模型中的體外轉(zhuǎn)運(yùn)

分別將ACE抑制肽AHLL、HSF和AHLL混合物及HSFAHLL包埋肽經(jīng)0.22 μm膜過(guò)濾除菌并在37 ℃預(yù)熱備用。

當(dāng)Transwell板上的Caco-2細(xì)胞的跨膜電阻大于250 Ω/cm2，可進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)[20]。用pH 7.4的HBSS溶液洗3 次，第3次洗滌時(shí)與細(xì)胞置于37 ℃培養(yǎng)箱中共浴15 min，將各孔內(nèi)HBSS液吸凈。對(duì)于AP側(cè)到BL側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)：將0.5 mL樣品加入AP側(cè)作為供給池，同時(shí)BL側(cè)加入1.5 mL空白HBSS作為接收池；對(duì)于BL側(cè)到AP側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)：將1.5 mL樣品加入BL側(cè)作為供給池，AP側(cè)加0.5 mL空白HBSS作為接收池。每次取樣150 μL，同時(shí)相應(yīng)補(bǔ)加37 ℃ 150 μL空白HBSS溶液，所有實(shí)驗(yàn)都3 次平行。樣品中AHLL含量用HPLC法測(cè)定。以表觀滲透系數(shù)Papp表示AHLL的轉(zhuǎn)運(yùn)量[21]，計(jì)算見(jiàn)式（2）：

式中：dQ×dt-1為滲透速率/（μmol/s），根據(jù)樣品在不同時(shí)間轉(zhuǎn)運(yùn)量對(duì)時(shí)間回歸得到的直線斜率；A為Transwell膜表面積/cm2；C0為加入Caco-2細(xì)胞模型的樣品初始質(zhì)量濃度/（μg/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)采用SPSS 13.0分析軟件，結(jié)果以 ±s表示，采用t檢驗(yàn)分析比較各組之間的差異性，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 AHLL質(zhì)量濃度對(duì)納米粒包埋效果的影響

在HSF濃度為2 μmol/L條件下，裝載不同終質(zhì)量濃度的AHLL溶液，制備過(guò)程中其他條件不變，研究AHLL質(zhì)量濃度對(duì)其包封率的影響。由圖1可以看出，隨著AHLL質(zhì)量濃度的增大，納米粒的包封率先顯著增大，之后出現(xiàn)平緩趨勢(shì)，又顯著減小。這可能是由于隨著AHLL質(zhì)量濃度不斷增大，載體蛋白包埋到一定程度后，包裹單位分子AHLL的鐵蛋白數(shù)量相對(duì)變少，載體包埋AHLL的概率降低，導(dǎo)致AHLL包埋不完全，載體蛋白對(duì)AHLL的包封率逐漸下降?？紤]到包埋濃度過(guò)低會(huì)造成AHLL在胃腸道中吸收作用不明顯，以及Caco-2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中AHLL的存活率，綜合比較，選擇AHLL終質(zhì)量濃度范圍在100～200 μg/mL之間。

圖 1 AHLL質(zhì)量濃度對(duì)納米粒包封率的影響Fig. 1 Effect of AHLL concentration on the encapsulation efficiency of nanoparticles

2.2 HSF濃度對(duì)納米粒包埋效果的影響

改變包埋體系中載體HSF濃度，相同實(shí)驗(yàn)條件下，體系中AHLL終質(zhì)量濃度為150 μg/mL，研究載體蛋白濃度對(duì)AHLL納米粒包封率的影響。從圖2可以看出，隨著HSF濃度的增大，納米粒的包封率先顯著增大至一定數(shù)值后趨于平緩，之后又出現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)，可見(jiàn)納米粒的包封率并不與載體蛋白濃度呈正相關(guān)關(guān)系。這可能是因?yàn)?，?dāng)載體蛋白濃度較小時(shí)，可以用來(lái)包埋AHLL的數(shù)量也較少，隨著HSF濃度的增加，可以形成HSF-AHLL納米粒的數(shù)量也增大，包封率隨之升高。然而，當(dāng)包埋的AHLL溶液達(dá)到飽和，納米粒的包封率也隨之趨于平緩。但是，再增大載體蛋白濃度后，體系中蛋白濃度過(guò)大而發(fā)生聚集形成較大顆粒[22]，會(huì)影響包埋效果，導(dǎo)致納米粒包封率出現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，選擇載體蛋白濃度在1～2 μmol/L范圍內(nèi)制備納米粒。

圖 2 HSF濃度對(duì)納米粒包封率的影響Fig. 2 Effect of HSF concentration on the encapsulation efficiency of nanoparticles

2.3 SA質(zhì)量濃度對(duì)納米粒包埋效果的影響

在HSF濃度2 μmol/L、載入AHLL終質(zhì)量濃度150 μg/mL、其他條件相同的條件下制備HSF-AHLL納米粒。調(diào)體系pH值為3.0，加入一系列不同質(zhì)量濃度的SA溶液，研究多糖質(zhì)量濃度對(duì)納米粒包封率的影響。從圖3可以看出，包封率開(kāi)始顯著升高，直到多糖質(zhì)量濃度為10 mg/L后趨于平衡。這是由于隨著SA質(zhì)量濃度的增加，與HSF-AHLL納米粒表面結(jié)合過(guò)程中包裹的AHLL也越多；但當(dāng)?shù)鞍妆砻嫱耆贿^(guò)量的SA分子占據(jù)時(shí)，大量多糖的親水鏈朝向水相，靜電斥力和空間位阻效應(yīng)阻止了體系中顆粒進(jìn)一步的相互靠近、接觸和聚集，溶液中粒徑較小的顆粒占主導(dǎo)[23]，獲得的HSF-SA-AHLL復(fù)合納米粒變得穩(wěn)定，從而納米粒的包封率也基本不變。因此，SA質(zhì)量濃度為10 mg/L就可以使復(fù)合納米粒包封率達(dá)到最高。

圖 3 SA質(zhì)量濃度對(duì)納米粒包封率的影響Fig. 3 Effect of SA concentration on the encapsulation efficiency of nanoparticles

2.4 粒徑和電位分析

表 1 HSF和HSF-AHLL的粒徑和電位Table 1 Particle size and potential of HSF and HSF-AHLL

如表1所示，空殼的HSF粒徑為19.62 nm，粒徑分布均勻。載入ACE抑制肽后，HSF-AHLL納米粒粒徑增大至28.19 nm，比空殼的HSF粒徑約大9 nm。由此，從粒徑大小證明了納米包埋體系是存在的，AHLL有可能被包埋在納米粒中。納米粒作為一種活性物質(zhì)的傳輸載體，其Zeta電位是考察體系的重要因素之一。納米粒電位的大小體現(xiàn)了納米粒膠體溶液的穩(wěn)定性，Zeta電位值越大，其表面同種電荷的相互排斥作用也越大，納米粒越不容易出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象，均勻地分散在溶液中，整個(gè)納米粒體系更加穩(wěn)定。表1中Zeta電位測(cè)定結(jié)果顯示HSF-AHLL和HSF表面都帶負(fù)電荷，HSF的電位為-39.9 mV，HSF-AHLL的電位約-34 mV，這些電荷保證了整個(gè)包埋體系的穩(wěn)定性。

柴智[14]研究表明，作為一種陰離子多糖，SA在pH 2.0～10.0范圍內(nèi)均帶有負(fù)電荷。為利用蛋白和多糖分子在酸性條件下的靜電吸引作用形成結(jié)構(gòu)緊密的絡(luò)合物，本實(shí)驗(yàn)選擇在pH 3.0的條件下制備HSF-SA-AHLL復(fù)合納米粒。圖4為SA質(zhì)量濃度對(duì)復(fù)合納米顆粒Zeta電位和粒徑的影響。結(jié)果顯示，隨著SA質(zhì)量濃度的增加，體系的Zeta電位值不斷降低，而粒徑值逐漸增加，至鐵蛋白表面電荷被完全中和，體系電荷呈中性狀態(tài)，再進(jìn)一步增大SA添加量，體系電位變成負(fù)值，聚合物解聚過(guò)程占主導(dǎo)地位，粒徑也逐漸變小。

圖 4 不同SA質(zhì)量濃度下復(fù)合納米粒的粒徑和Zeta電位Fig. 4 Particle size and zeta potential of composite nanoparticles with different SA concentrations

由于隨著SA質(zhì)量濃度的增加，體系中負(fù)電荷量逐漸增大，蛋白表面也完全被過(guò)量的SA分子占據(jù)，大量多糖的親水鏈朝向水相，同時(shí)靜電斥力和空間位阻效應(yīng)阻止了體系中顆粒進(jìn)一步的相互靠近、接觸和聚集，導(dǎo)致溶液中粒徑較小的顆粒占主導(dǎo)，均勻分布在其中，使得體系更加穩(wěn)定[23]。本實(shí)驗(yàn)研究表明，SA質(zhì)量濃度高于10 mg/L后，體系的Zeta電位和粒徑均處于平臺(tái)期，不再隨其質(zhì)量濃度的變化而變化，制備的HSF-SA-AHLL復(fù)合納米粒體系更穩(wěn)定。

2.5 透射電子顯微鏡分析

圖 5 透射電子顯微鏡圖Fig. 5 Transmission electron micrographs

如圖5所示，空殼HSF為均一的球形，蛋白中心有少許黑點(diǎn)，這可能是馬脾蛋白脫鐵時(shí)殘留的Fe元素。由圖5B可以看出，納米粒HSF-AHLL也是球形，鐵蛋白空殼中有一顆顆小分子物質(zhì)被包裹其中，ACE抑制肽AHLL在鐵蛋白亞基重組過(guò)程中被包埋進(jìn)去，說(shuō)明此包埋納米粒體系是存在的[24]。圖5C顯示：SA沒(méi)有出現(xiàn)明顯的多糖聚集狀態(tài)。而且，HSF-SA-AHLL復(fù)合納米粒也有與HSF-AHLL納米粒相似的球形形態(tài)，只是直徑較前者大。透射電子顯微鏡結(jié)果表明HSF的粒徑約20 nm，HSFAHLL納米粒的粒徑為30 nm，HSF-SA-AHLL復(fù)合納米粒的粒徑約為150 nm，與Malvern Nano ZS90納米粒徑儀測(cè)定的粒徑值基本一致，表觀證明了HSF-AHLL和HSF-SAAHLL形成了穩(wěn)定的納米體系。

2.6 不同處理的AHLL在Caco-2細(xì)胞單層模型上吸收效果

圖6顯示了AHLL、AHLL和HSF混合物以及HSFAHLL包埋納米粒在Caco-2細(xì)胞單層模型上的吸收量在AP→BL和BL→AP兩個(gè)方向隨時(shí)間的變化情況。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，不同處理的AHLL在兩個(gè)方向的轉(zhuǎn)運(yùn)量都呈現(xiàn)不斷升高的趨勢(shì)，反映了AHLL的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)時(shí)間的依懶性[25-26]。而其在Caco-2細(xì)胞單層的滲透在90 min以內(nèi)呈線性增長(zhǎng)，在150 min時(shí)呈飽和狀態(tài)，這個(gè)平臺(tái)可能是由于濃度梯度的缺少和一些活性載體的飽和造成的[27-28]，表明主動(dòng)運(yùn)輸和被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)同時(shí)存在。在AP→BL和BL→AP兩個(gè)方向，其表觀滲透系數(shù)均大于10-6cm/s（表2），表明AHLL在人體腸道中的吸收較好[29]。

圖 6 不同處理的AHLL在Caco-2細(xì)胞模型上雙向轉(zhuǎn)運(yùn)的時(shí)效關(guān)系Fig. 6 Time-effect relationship of two-way transport of AHLL with different treatments in Caco-2 cell model

表 2 不同處理的AHLL表觀滲透系數(shù)（n=3）Table 2 Apparent permeability coefficients of AHLL with different treatments (n= 3)

對(duì)于AP→BL方向的轉(zhuǎn)運(yùn)，同一時(shí)間內(nèi)，HSF-AHLL包埋納米粒明顯比單獨(dú)的AHLL及HSF和AHLL混合物在Caco-2細(xì)胞單層模型上轉(zhuǎn)運(yùn)量大，且表觀滲透系數(shù)（第90分鐘）也明顯高于后兩者，這是由于HSF作為納米包埋材料，對(duì)AHLL形成保護(hù)壁壘[30]，減少了消化道中蛋白酶對(duì)其降解量，從而有效提高了AHLL在人體消化系統(tǒng)中的吸收效果。對(duì)于BL→AP方向的轉(zhuǎn)運(yùn)，如表2所示，HSF和AHLL混合物以及HSF-AHLL納米粒相比單獨(dú)的AHLL，其表觀滲透系數(shù)沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），如何減小外排作用還需進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用鐵蛋白在強(qiáng)酸條件下可逆組裝性質(zhì)和多糖的控釋作用，通過(guò)HSF和SA靜電吸引形成良好的復(fù)合包埋載體。將ACE抑制肽AHLL裝載到鐵蛋白的空腔內(nèi)，以期研究得到的高活性HSF-AHLL及HSF-SA-AHLL納米粒，其形態(tài)呈球形。研究表明制備納米粒的最優(yōu)條件為載體HSF濃度1～2 μmol/L、多糖質(zhì)量濃度10 mg/L、AHLL終質(zhì)量濃度100～200 μg/mL，可制備出包封率較高的納米粒體系。通過(guò)粒徑和電位測(cè)定分析，相比游離的ACE抑制肽AHLL，裝載在HSF空腔中形成的納米粒體系更加穩(wěn)定。同時(shí)，通過(guò)HSF-AHLL在Caco-2細(xì)胞單層模型中的體外轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，其比游離AHLL在小腸中吸收效果更好。因此，鐵蛋白和SA作為一種雙壁材納米載體，可成功用于包埋ACE抑制肽AHLL，且HSF-AHLL納米粒有效提高了ACE抑制肽AHLL在消化系統(tǒng)中的吸收效果。本實(shí)驗(yàn)可對(duì)食品加工中小分子活性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的穩(wěn)定性保持和高效吸收提供一定的參考依據(jù)。