李劍美 ，李學玲 ，，陳錦盛 ，周仕順 ，陶 川 ，，漆麗萍 ，趙 鋒 ，*

（1.云南省高校民族醫(yī)藥資源研究東南亞國際合作重點實驗室，云南 普洱 665000；2.云南省高校亞熱帶藥用食用資源開發(fā)與利用重點實驗室，云南 普洱 665000；3.普洱學院生物與化學學院，云南 普洱 665000；4.中國科學院西雙版納熱帶植物園，云南 勐臘 666303）

2010版《中國藥典》規(guī)定使用的白芨藥材為蘭科植物白芨 (Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.)的干燥塊莖[1]。位于滇西南地區(qū)的普洱市擁有世居民族有14種，野生植物資源豐富，在治療常見病、多發(fā)病方面有著獨特的癥療經(jīng)驗和用藥習慣[2-4]。李劍美等[5]在調(diào)查普洱野生藥材市場時發(fā)現(xiàn)筒瓣蘭 (當?shù)孛麨樾“总?、苞舌蘭 (當?shù)孛麨橥涟总?、小白芨代替白芨使用的現(xiàn)象普遍，其中，以筒瓣蘭尤甚。目前筆者尚未見關(guān)于筒瓣蘭、苞舌蘭化學成分的報道。本實驗首次對筒瓣蘭、苞舌蘭的化學成分進行預(yù)實驗，以明確其可能的化學成分[6-9]，同時利用中國藥典白芨的薄層色譜法鑒別三者的異同，初步探知他們的化學成分的類型及其差異，試探討白芨及其替代品之間的相似性，為尋找治療支氣管炎和久咳傷肺的新藥材資源奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

材料：普洱市藥材市場共發(fā)現(xiàn)有2種常見的白芨代用品分別“小白芨”、土白芨，對其原植物追蹤調(diào)查，經(jīng)中國科學院西雙版納熱帶植物園標本館周仕順工程師鑒定為蘭科植物的筒瓣蘭和苞舌蘭。取一定量的白芨 (中國食品藥品檢定研究院，批號：121262-201405)及筒瓣蘭、苞舌蘭的假鱗莖切成薄片，在45～50℃的鼓風干燥箱中干燥后粉碎，過0.25mm的篩，得粗粉。

儀器：手提式藥材粉碎機 (LK-200A)、電子天平 (SHIMADZVAY120)、數(shù)控超聲波清洗器(KQ3200DE)、DK-S26型電熱恒溫水浴鍋 (上海精宏實驗設(shè)備有限公司)、三用紫外儀 (CAMAG REPROSTAR3)，紫外分光光度計 (UV-2550)。

2 方法

2.1 化學成分預(yù)試驗

2.1.1 水提取液制備

分別取白芨、筒瓣蘭、苞舌蘭的粗粉各10 g，加蒸餾水100 mL，在室溫下浸泡過夜，濾液和藥渣在50～60℃水浴加熱1 h，過濾，濾液即為熱水提取液，用作總糖、還原糖、皂苷的檢查。

2.1.2 乙醇提取液制備

分別取白芨、筒瓣蘭、苞舌蘭的粗粉各10 g，加95%乙醇100mL，加熱回流1h，過濾，濾液分為兩部分。一份作為乙醇提取液，用作酚類的檢查。另一份繼續(xù)加熱至無醇味，約為10mL，再一分為二，其中3mL放冷后加5%鹽酸溶解，過濾，濾液作為生物堿的檢查；另外7mL加95%乙醇5mL、石油醚10mL、水3mL，分離出醇液，再加30mL 95%乙醇，用作黃酮類、蒽醌類的檢查。

2.1.3 石油醚提取液制備

分別取白芨、筒瓣蘭、苞舌蘭的粗粉各2g，加10mL石油醚 (60～90℃)，密塞，室溫放置3～4h，過濾，濾液即為石油醚提取液，用作揮發(fā)油、油脂、甾體或三萜類成分的檢查。

2.1.4 預(yù)試方法

采用《天然藥物化學》和《中藥化學》介紹的傳統(tǒng)試管預(yù)試方法進行[10-11]。

2.2 黃酮含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取在120℃下干燥至恒重的蘆丁標準品 (98%)54mg，用40mL 60%乙醇，置水浴鍋上微熱使溶解,放冷至室溫，用60%的乙醇定容至50mL，搖勻得濃度為1.008mg/mL的標準儲備液。

2.2.2 供試品溶液的制備

稱取約2g樣品，加40mL 95%乙醇，浸泡20 min，超聲波提取30min，抽濾。濾渣再加40mL 95%乙醇，浸泡20min，再次超聲波提取30 min，抽濾，合并兩次濾液，得供試品溶液。

2.2.3 蘆丁標準曲線繪制

準確稱取蘆丁標準品 (98%)5.4mg，用60%乙醇溶解，定容至 5mL，得濃度為1.008mg/mL的標準儲備液。分別準確吸取標準儲備液 0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20mL 于 7 只 25 mL容量瓶中，加10mL 30%乙醇和5%NaNO2溶液1.0mL，搖勻，放置6min，加10%Al(NO3)3溶液1.0mL，搖勻，放置6min，加1mol/L NaOH溶液10mL，加水稀釋至刻度，搖勻，放置10～15min，用UV-2550紫外分光光度計于500nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線。

2.2.4 黃酮樣品濃度含量的測定

準確吸取供試品溶液1.00mL，按2.2.3的“加10mL 30%乙醇和5%NaNO2溶液1.0mL.......放置10～15min”操作，用UV-2550紫外分光光度計于500nm波長處測定吸光度并計算樣品黃酮濃度。

w （黃酮） =[（C×V×N） /m] ×100%

其中：C根據(jù)所測定溶液的吸光度值，代入回歸方程計算出相應(yīng)的總黃酮含量；m為試驗稱取筒瓣蘭的質(zhì)量；N為稀釋的倍數(shù)；V為測定時筒瓣蘭的定容體積

2.3 總糖和還原糖的含量測定

2.3.1 對照品溶液的制備

準確稱取烘干至恒重的葡萄糖對照品100mg，置于100mL容量瓶中，加水配置成1mg/mL溶液。然后分別精密量取10mL置于100mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻即得0.1mg/mL的葡萄糖溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備

取樣品，60℃烘烤4h，粉碎，過40目篩，精密稱取0.200g，加入20mL石油醚于100mL平底燒瓶中，水浴回流30min，放冷，濾過。待濾渣中的石油醚揮干后，濾渣連同濾紙置于平底燒瓶中，加入20mL蒸餾水，沸水浴中放置2h，放冷，濾過，以蒸餾水洗滌3次，合并濾液于50mL量瓶中，定容。精密吸取1mL作為測定還原糖的供試品溶液;另取1mL，定容至25mL，精密吸取1mL作為測定總糖的供試品溶液。

2.3.3 總糖標準曲線的繪制

分別吸取0.1mg/mL葡萄糖對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL置于10ml帶塞子的試管中，用蒸餾水補至1.0mL，空白對照為蒸餾水1.0mL，各加入蒽酮試劑5mL，迅速浸于冰水浴中冷卻，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加蓋，以防蒸發(fā)。自水浴重新煮沸起，準確煮沸l(wèi)0 min取出，用冰浴冷卻至室溫，在620nm波長下以第一管為空白，迅速測其余各管吸光值。以標準葡萄糖含量 (μg)為橫坐標，以吸光值為縱坐標，作出標準曲線。

2.3.4 還原糖標準曲線繪制

分別吸取1mg/mL葡萄糖對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL置于25mL帶塞子的試管中，用蒸餾水補至2.0mL，空白對照為蒸餾水2.0mL各加入3,5-二硝基水楊酸1.5mL，將各管搖勻，在沸水浴中加熱5min，取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫，再以蒸餾水定容至25mL，加塞后顛倒混勻。在540nm波長下，用1號管為參比管調(diào)零，分別讀取各管的吸光度。以吸光度為縱坐標，葡萄糖毫克數(shù)為橫坐標繪制標準曲線。

2.3.5 總糖和還原糖樣品濃度測定

準確吸取樣品供試品溶液0.5 mL(取3份)，置于10mL帶塞子的試管中，加蒸餾水補至1.0 mL，加蒽酮試劑5mL，迅速振搖混勻，以蒸餾水制備液為空白，在620nm處測其吸光度值測吸光度，利用回歸方程計算總糖樣品濃度。

2.3.6 總糖和還原糖計算方法

其中：C為在標準曲線上查出的總糖含量 (mg）；V總為提取液總體積（mL）；V測為測定時取用體積（ml）；D為稀釋倍數(shù)；W為樣品重量（g）

2.4 薄層色譜鑒定

薄層色譜比較鑒定按中國藥典的相關(guān)要求進行規(guī)范操作。具體方法為：取中藥白芨和替代品（筒瓣蘭、苞舌蘭） 粉末各2g，加70%甲醇20mL，超聲處理30min，過濾，濾液蒸干，殘渣加水10mL使溶解，用乙醚振蕩提取2次，每次20mL，合并乙醚液，濃縮至1mL，作為供試品溶液。參考薄層色譜法（附錄ⅥB）試驗，吸取供試品溶液5～10 uL，中藥白芨樣品分別與替代藥材兩兩滴于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇（6∶2.5∶1） 為展開劑，展開，取出、晾干，置紫外燈（365nm）下檢視顯色結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 化學成分系統(tǒng)預(yù)試驗結(jié)果

根據(jù)各類成分特有的化學反應(yīng)如顏色反應(yīng)、沉淀反應(yīng)等做一般定性預(yù)實驗，從而得知供試品溶液中可能含有的化學成分類型。結(jié)果見表1～2。

3.2 白芨及其代用品黃酮、總糖、還原糖含量結(jié)果分析

3.2.1 蘆丁標準曲線

以吸光度A對濃度c做標準曲線如圖1所示，線形回歸方程：A=0.0096C+0.0027，R2=0.9961。表明蘆丁在0～48.384ug/ml范圍內(nèi)濃度與吸光度有良好的線性關(guān)系。

3.2.2 葡萄糖標準曲線

表1 白芨及其代用品水供試液、石油醚供試液成分預(yù)試結(jié)果

以吸光度A對濃度c做標準曲線如圖2所示，線形回歸方程：A=49.4491C-0.0532（R2=0.9916），表明葡萄糖在0～0.01mg/ml范圍內(nèi)濃度與吸光度有良好的線性關(guān)系。

表2 白芨及其代用品乙醇供試液成分預(yù)試結(jié)果

圖1 蘆丁標準曲線

圖2 葡萄糖標準曲線

圖3 還原糖標準曲線

“+”表示陽性，“-”表示陰性

3.2.3 還原糖標準曲線

以吸光度A對濃度c做標準曲線如圖3所示，線形回歸方程：A=16.7C-0.0266，R2=0.9985。表明葡萄糖在0～0.048 ug/ml范圍內(nèi)濃度與吸光度有良好的線性關(guān)系。

根據(jù)以上標準曲線換算后，分別測得白芨、筒瓣蘭、苞舌蘭的總糖、還原糖和黃酮的平均值見表3，對三種植物的結(jié)果進行單因素方差分析。白芨、筒瓣蘭、苞舌蘭的總糖、還原糖和黃酮均存在顯著差異（Dunnett T3,P＜0.001）。其中總糖：白芨＞筒瓣蘭＞苞舌蘭，且三者之間均呈顯著差異；還原糖：白芨＞苞舌蘭＞筒瓣蘭，苞舌蘭和白芨之間差異未達到顯著差異水平，但二者均與筒瓣蘭呈顯著差異；黃酮：筒瓣蘭＞白芨＞苞舌蘭，且三者之間均呈顯著差異。

表3 白芨總糖、還原糖和黃酮含量統(tǒng)計表

3.3 薄層色譜研究結(jié)果

如圖4和圖5顯示，從薄層斑點的數(shù)目、位置等特征可以有效地區(qū)別白芨、苞舌蘭、筒瓣蘭3種同科同亞組的植物。跑板以后將其置于365nm的紫外燈下檢視，由圖5可知：白芨共有5個藍紫色熒光點，其Rf值依次為2.53cm，4.10cm，4.50cm，4.95cm和5.55cm；筒瓣蘭有2個藍紫色熒光點，其Rf值分別為4.10cm和4.95cm；苞舌蘭有3個藍紫色熒光點，其Rf值依次為2.53cm，4.10cm和4.50cm。將板浸入到濃硫酸顯色，迅即拿出用吹分機吹干，得圖4可知：白芨共有8條顯色帶，其Rf值依次為1.60cm， 2.53cm， 3.20cm， 3.75cm， 4.10cm，4.50cm，4.95cm，5.55cm；筒瓣蘭共獲得9條顯色帶，其Rf至依次為1.60cm，2.14cm，2.53cm，3.06cm， 3.50cm， 4.10cm， 4.50cm， 4.95cm，5.55cm；苞舌蘭共獲得8條顯色帶，其Rf至依次為1.60cm，2.14cm，2.53cm，3.06cm，3.50cm，4.10cm，4.50cm，5.55cm。

圖4 白及及其代用品薄層色譜 (濃硫酸顯色)

按照2010版《中國藥典》檢測要求，在365nm處苞舌蘭與筒瓣蘭共有3個（Rf2.53cm，4.10cm和4.50cm值） 和2個熒光點（Rf4.10cm和4.95cm）與白芨一致，說明說明筒瓣蘭、苞舌蘭與中藥白芨成分相似，具有一定的代替價值。該檢測方法下白芨的特征帶清晰、數(shù)量多，苞舌蘭、筒瓣蘭的特征帶較少、清晰度較差，說明此檢測方法適用于白芨藥材的鑒別，可能相較于筒瓣蘭和苞舌蘭的色譜條件還應(yīng)在進行摸索改進，但是同時也再次驗證了此檢測方法適用于白芨藥材的鑒別。

圖5 白及及其代用品薄層色譜 (365nm)

4 討論

4.1 關(guān)于白芨、筒瓣蘭和苞舌蘭化學成分預(yù)實驗

系統(tǒng)的化學成分預(yù)實驗的實驗結(jié)果表明：白芨、筒瓣蘭、苞舌蘭三種植物的化學成分非常相似，均含有氨基酸、糖類、甙類、鞣制、有機酸、生物堿、皂苷、黃酮類、酚類、內(nèi)酯、香豆素及其苷類、強心苷、甾萜類等物質(zhì)，其中以多糖和黃酮類反應(yīng)比較明顯。他們所含的這些化學成分具有多種生理活性和應(yīng)用前景，例如，黃酮類化合物是治療心血管系統(tǒng)疾病的重要藥物、還具有保肝、抗菌、抗病毒、解痙等作用[12]；多糖是所有生命有機體的重要組成成分和維持生命所必需的結(jié)構(gòu)材料[13]；多數(shù)生物堿都具有抗癌、抗腫瘤、抗炎、抗病毒以及抗血小板凝集、抗心律失常以及抗高血壓等心血管疾病的作用[14]。

4.2 白芨及其代用品黃酮和多糖的含量比較

白芨、筒瓣蘭和苞舌蘭雖然均含有總糖、還原糖和黃酮，但是其含量具有差異顯著性，其中常用中藥白芨總糖和還原糖的含量均顯著高于二者，而筒瓣蘭總黃酮量高于中藥白芨。筒瓣蘭在滇南地區(qū)常用于治療久咳、支氣管炎，部分民間醫(yī)生還利用其治療心臟疾病，這可能與其含有較高的黃酮類化合物有關(guān)。

新藥資源的開發(fā)理論依據(jù)之一是利用近緣屬種植物成分的相似特點，發(fā)掘新資源的方法。白芨、筒瓣蘭、苞舌蘭屬于同科植物，其藥用部位均為假鱗莖，綜合以上的化學成分預(yù)實驗定性分析和其反應(yīng)較為顯著的多糖和黃酮的定量分析，代用品與白芨正品間大類成分極為相似，說明替代品具有一定的代用價值；多糖的含量白芨顯著高于替代品，總黃酮的含量筒瓣蘭顯著高于白芨和苞舌蘭，說明白芨作為常見中藥的客觀性，也揭示了筒瓣蘭在某些藥效方面可能要強于中藥白芨。應(yīng)加強筒瓣蘭的具體化學成分和藥理作用的研究，以期能夠發(fā)掘新的藥物資源。

4.3 白芨及其代用品薄層色譜的比較

正品白芨和幾種代用品來源相近，都屬于蘭科、蘭亞科、樹蘭組族植物，藥用部位均屬于鱗莖。通過薄層色譜也可看出，苞舌蘭與白芨熒光點最近，筒瓣蘭次之。從親緣關(guān)系越近其化學成分越相似可初步推斷苞舌代用價值最高，其次是筒瓣蘭。

滇西南地區(qū)是一個多民族邊疆地區(qū)，受歷史、地理、文化和交通等因素的影響，形成了極具地理性和民族性的醫(yī)藥系統(tǒng)，在治療常見病、多發(fā)病方面有著獨特的癥療經(jīng)驗和用藥習慣，與傳統(tǒng)中藥相比，充分體現(xiàn)了同病異治的現(xiàn)象。因此應(yīng)更加深入的挖掘此區(qū)的藥物資源，豐富中華民族的醫(yī)藥資源庫。