馮晴霞，閆宇寧，楊 嶧，周嘉寧，李樂斌，盧學春*，安麗萍,*

（1.北華大學藥學院，吉林 吉林 132013；2.中國人民解放軍總醫(yī)院血液科，北京 100853）

人體細胞及組織的衰老是指在結(jié)構(gòu)和機能上出現(xiàn)退行性變化，在衰老過程中神經(jīng)系統(tǒng)逐步衰退進而產(chǎn)生學習記憶能力減退等現(xiàn)象[1-2]。機體氧化應激程度加劇是衰老發(fā)生的重要原因，而氧化應激的程度取決于氧化與抗氧化體系的平衡[3-6]。因此，提高機體的抗氧化能力可以延緩衰老進程。天然產(chǎn)物中含有大量的抗氧化活性物質(zhì)，將天然抗氧化活性物質(zhì)用于預防衰老及相關(guān)疾病已成為現(xiàn)代生物研究領(lǐng)域的熱點。

真菌作為天然產(chǎn)物的重要來源，其抗氧化活性物質(zhì)的研究已顯示出廣闊的發(fā)展前景。姬松茸（Agaricus blazei Murill）又名小松菇、巴西蘑菇，是一種大型真菌，具有濃郁杏仁香味，屬擔子菌亞門層菌綱傘菌目蘑菇（黑傘）科蘑菇（黑傘）屬[6]。姬松茸子實體中富含蛋白質(zhì)、糖類、甾醇、黃酮等多種生物活性物質(zhì)，具有廣泛的生物活性，如抗腫瘤、降血糖、抗炎、增強免疫力等[7-8]。姬松茸蛋白具有明顯的抗氧化和提高乙酰膽堿酯酶活性等功效[9]。蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶部分水解后，可獲得具有生物活性的多肽；與大分子蛋白相比，活性生物多肽具有安全穩(wěn)定、易溶于水、易吸收等優(yōu)點，且其清除自由基的能力與分子質(zhì)量有關(guān)，分子質(zhì)量越小，其抗氧化能力越強[10-12]。姬松茸多肽是姬松茸子實體中提取的蛋白質(zhì)經(jīng)過蛋白酶水解后的活性物質(zhì)，本課題組前期實驗證明，姬松茸多肽對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基和羥自由基均具有較好的清除作用，體外抗氧化作用明顯，但其抗衰老作用和機制還需要進一步研究。

本研究優(yōu)化姬松茸多肽的提取方法，通過建立D-半乳糖（D-galactose，D-gal）誘導的小鼠衰老模型，觀察姬松茸多肽對衰老模型小鼠的保護作用，為姬松茸的應用提供更多的理論及實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

S P F級雄性I C R小鼠（4～5 周齡，體質(zhì)量（20.0±2.0）g，n＝40，生產(chǎn)許可證號：SCXK（吉）-2016-0003）及飼料 長春億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司；姬松茸子實體粉末 江蘇省蘇威微生物研究有限公司。

Sephadex G-50 中國長征制藥廠；D-gal 美國Sigma-Aldrich公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究院；核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）、NAD(P)H∶醌氧化還原酶（NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1，NQO1）、谷氨酸半胱氨酸連接酶（glutamate-cysteine ligase，GCLM）、β-actin引物、BCA蛋白定量試劑盒 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒、一步法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒 諾唯贊生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550型紫外-可見分光光度計 島津國際貿(mào)易（上海）有限公司；MT-200 Morris水迷宮分析儀、BA-200小鼠避暗儀 成都泰盟科技有限公司；PCR儀美國Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 姬松茸多肽的提取

將姬松茸子實體粉末去除顆粒雜質(zhì)，稱取一定量與蒸餾水以1∶2（m/V）比例混合，于冰上勻漿后5 000×g離心3 min，取上清液，加入0.157 g/mL硫酸銨溶液，在4 ℃下將上清液中的可溶性蛋白質(zhì)沉淀過夜，4 000×g離心10 min，合并沉淀。用去離子水溶解沉淀，并使用截留分子質(zhì)量30 kDa的透析膜在4 ℃下用去離子水透析24 h，透析后冷凍干燥制得姬松茸蛋白粉。取一定量姬松茸蛋白粉按1∶20（m/V）加入蒸餾水，用0.1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至2.5，加入胃蛋白酶解液（3 000 U/mg），混勻后置于37 ℃恒溫水浴中水解4 h，酶解結(jié)束后，100 ℃加熱10 min滅酶，冷凍干燥制得初步提取粗多肽級分。

1.3.2 姬松茸多肽的純化

稱取Sephadex G-50（50～100 目）約50 g，加入1 L純凈蒸餾水中，于室溫（22 ℃）下靜置3 h，進行溶脹。垂直安裝色譜柱，蒸餾水平衡3 h后加樣，以蒸餾水為洗脫液進行洗脫，流速1 mL/min，檢測波長280 nm。收集組分冷凍干燥，即為姬松茸多肽提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測定得到姬松茸多肽提取物中多肽質(zhì)量分數(shù)為87%。

1.3.3 姬松茸多肽的鑒定

采用Tricine-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）鑒定小分子肽，凝膠制備參考表1。取樣品溶液10 μL，加入40 μL樣品緩沖液后，沸水浴冷卻后上樣。按預定順序加樣后電泳電壓為60 V，當樣品進入分離膠后，120 V恒壓繼續(xù)電泳直至溴酚藍移動至分離膠底部。電泳結(jié)束后取出凝膠染色1 h，脫色液脫色。

表1 Tricine-SDS-PAGE凝膠的組成Table 1 Compositions of Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis gel

1.3.4 實驗動物分組與給藥

選取6 周齡雄性ICR小鼠40 只，喂養(yǎng)7 d，隨機分為4 組，每組10 只，分別為空白組、模型組、姬松茸多肽組和陽性藥物（吡拉西坦）組。除空白組外，其余各組小鼠每日固定時間皮下注射D-gal 300 mg/（kgmb·d），空白組小鼠注射相同劑量的生理鹽水。同時，陽性對照組小鼠灌胃400 mg/（kgmb·d）吡拉西坦，姬松茸多肽組小鼠灌胃400 mg/（kgmb·d）姬松茸多肽提取物，空白組、模型組小鼠每日灌胃等量蒸餾水，持續(xù)6 周。

1.3.5 避暗實驗

末次給藥后第2天進行避暗實驗。小鼠放入明室中，使其適應環(huán)境后給予5 min持續(xù)電流，小鼠進入暗室即受電擊返回明室，實驗重復2 d。從實驗開始至第1次進入暗室的時間記為潛伏期，實驗開始5 min內(nèi)小鼠進入暗室的次數(shù)記為錯誤次數(shù)，記錄小鼠潛伏期和錯誤次數(shù)。實驗期內(nèi)未進入暗室的小鼠潛伏期計為300 s[13]。

1.3.6 Morris水迷宮實驗

末次給藥后第2天進行Morris水迷宮實驗檢測小鼠的空間學習記憶能力。固定隱形平臺位置，將各組小鼠沿池壁從定點放入水池，記錄每只小鼠在120 s內(nèi)到達隱形平臺的時間（逃避潛伏期），并能夠在隱形平臺區(qū)停留10 s。若超過120 s則記為120 s，共訓練6 d。第7天撤去平臺，隨機選下水點，記錄120 s內(nèi)小鼠分別在中心區(qū)、中環(huán)、目標象限的游泳穿梭次數(shù)[14-15]。

1.3.7 生化指標檢測

末次給藥結(jié)束第2天處死小鼠，眼球取血，4 ℃、10 000×g離心分離血清。T-AOC采用比色法測定；CAT活力采用黃嘌呤氧化酶法測定，以每毫克血紅蛋白計；MDA濃度采用硫代巴比妥酸法測定；ROS水平使用熒光探針2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽進行檢測，以每毫升血清的熒光強度表示ROS水平。具體操作流程按照試劑盒說明書進行。

1.3.8 小鼠腦組織海馬區(qū)及周圍組織形態(tài)病理學觀察

末次給藥后第2天，小鼠注射0.2 mL 10 g/100 mL水合氯醛溶液麻醉后開胸，在右心耳處剪開，緩慢灌注20 mL磷酸鹽緩沖液和20 mL 4 g/100 mL多聚甲醛，灌注后取全腦，脫水后冷凍切片。加入體積比1∶1的乙醚-乙醇固定5～10 s，自來水沖洗2～5 s，加入蘇木精染液滴染1～2 min，自來水沖洗2～5 s，再加入鹽酸-乙醇（體積比1∶99）分化液反應2～5 s，自來水沖洗2～5 s，加入1%氨水反藍，自來水沖洗5～10 s，加入伊紅染液染色2～5s，自來水沖洗，進行蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色。染色結(jié)束后，分別用體積分數(shù)80%、92%和無水乙醇脫水，按體積比1∶3加入苯酚二甲苯反應2～5 s，再加入二甲苯透明3 次，中性樹膠封片，觀察小鼠腦組織海馬區(qū)及周圍組織形態(tài)變化。

1.3.9 RT-PCR檢測Nrf2、NQO1、GCLMmRNA相對表達量

小鼠取腦組織海馬區(qū)應用試劑盒提取組織中總RNA。按照試劑盒說明書進行RT-PCR擴增，PCR條件為：50 ℃、30 min；94 ℃、3 min；94 ℃、30 s，30 個循環(huán)；55～58 ℃、30 s，30 個循環(huán)；72 ℃、30 s，30 個循環(huán)；72 ℃、5 min；37 ℃、4 min。以β-actin為內(nèi)參，計算Nrf2、NQO1、GCLMmRNA的相對表達量。引物設(shè)計見表2。

表2 RT-PCR引物Table 2 Primer sequences used for RT-PCR

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理各組數(shù)據(jù)，結(jié)果用平均值±標準差表示，選用t檢驗判斷結(jié)果的顯著性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 姬松茸多肽的純化結(jié)果

圖1 姬松茸多肽粗提物的Sephadex G-50凝膠層析圖Fig. 1 Sephadex G-50 chromatogram of crude peptide extract from Agaricus blazei

由圖1可知，經(jīng)過Sephadex-50葡聚糖凝膠過濾后洗脫，洗脫曲線出現(xiàn)2 個波峰，12 min處呈現(xiàn)出1 個明顯的波峰即為姬松茸多肽。

2.2 姬松茸多肽的Tricine-SDS-PAGE結(jié)果

圖2 姬松茸多肽提取物的Tricine-SDS-PAGE圖Fig. 2 Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis of puri fi ed peptide extract from Agaricus blazei

將酶解后的姬松茸粗多肽級分和純化后的姬松茸多肽提取物進行Tricine-SDS-PAGE。由圖2可知，酶解后的姬松茸粗多肽級分分子質(zhì)量在6～70 kDa內(nèi)均有分布；而經(jīng)Sephadex-50葡聚糖凝膠純化后的姬松茸多肽提取物，顯示均一條帶，分子質(zhì)量在10 kDa左右。

2.3 姬松茸多肽對小鼠一般情況的影響

給藥實驗結(jié)束后，空白組小鼠組行動活躍，反應靈敏，且毛色光滑。模型組小鼠毛色發(fā)黃、無光澤，皮膚松弛，行動緩慢，精神萎靡，四肢無力，易抓取，呈趴伏蜷縮態(tài)，出現(xiàn)明顯的衰老特征。姬松茸多肽組與陽性藥物組小鼠毛色發(fā)暗、臟亂，但無明顯毛發(fā)稀疏的現(xiàn)象，其中個別呈趴伏蜷縮態(tài)，且有弓背現(xiàn)象，剩余小鼠外觀及狀態(tài)介于空白組與模型組之間。

2.4 小鼠避暗實驗結(jié)果

圖3 小鼠避暗實驗錯誤次數(shù)（A）和潛伏期時間（B）（n＝10）Fig. 3 Effect of puri fi ed peptide extract from Agaricus blazei on number of errors (A) and step-through latency in mice (B) (n = 10)

由圖3可知，與空白組比較，模型組小鼠避暗實驗2 d內(nèi)錯誤次數(shù)顯著增高，潛伏期時間（48 h）顯著縮短（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥物組小鼠錯誤次數(shù)顯著減少（P＜0.05），潛伏期時間（48 h）顯著延長（P＜0.05），姬松茸多肽組小鼠錯誤次數(shù)顯著減少（P＜0.05或P＜0.01），潛伏期時間（48 h）極顯著延長（P＜0.01）。

2.5 Morris水迷宮實驗結(jié)果

3 Morris水迷宮實驗中小鼠的逃避潛伏期（ ＝10）Table 3 Effect of purififi ed peptide extract from Agaricus blazei on escape latency of mice in Morris water maze ( = 10)

表4 Morris水迷宮實驗中小鼠的游泳穿梭次數(shù)（ ＝10）Table 4 Effect of purififi ed peptide extract from Agaricus blazei on platform-crossing number of mice in Morris water maze ( = 10)

由表3、4可知，與空白組比較，模型組小鼠在定位航行（水迷宮實驗）中的逃避潛伏期（除第1天）顯著延長（P＜0.05或P＜0.01），同時中心區(qū)和中環(huán)的穿梭次數(shù)顯著減少（P＜0.05或P＜0.01），目標象限的穿梭次數(shù)稍有減少但不顯著。與模型組比較，姬松茸多肽組小鼠定位航行中的逃避潛伏期顯著縮短，且實驗期內(nèi)呈遞減趨勢，第6天時逃避潛伏期僅為24.23 s，較模型組（85.28 s）極顯著降低（P＜0.01）。模型組小鼠穿越中心區(qū)次數(shù)僅有1 次，姬松茸多肽組小鼠約為3 次，穿越次數(shù)極顯著增多（P＜0.01）。與模型組小鼠比較，姬松茸多肽組小鼠穿越中環(huán)次數(shù)顯著增多（P＜0.05）。

2.6 姬松茸多肽對小鼠血清生化指標的影響

表5 小鼠血清MDA、CAT、ROS、T-AOC水平（ ＝8）Table 5 Effect of purififi ed peptide extract from Agaricus blazei on MDA, CAT, ROS and T-AOC levels in serum of mice ( = 8)

由表5可知，與空白組比較，模型組小鼠血清MDA濃度極顯著升高（P＜0.01），ROS水平顯著升高（P＜0.05），CAT活力和T-AOC顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，姬松茸多肽組小鼠血清MDA濃度顯著降低（P＜0.05），ROS水平極顯著降低（P＜0.01），CAT活力和T-AOC極顯著升高（P＜0.01）。

2.7 小鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學變化

圖4 HE染色觀察小鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化（×200）Fig. 4 Morphological changes of hippocampal neurons observed by HE staining (× 200)

由圖4可知，空白組小鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元排列緊密有序，胞核和胞漿清晰可見，單個細胞面積較大。而模型組與空白組相比，小鼠腦組織海馬區(qū)錐體神經(jīng)元結(jié)構(gòu)松散，排列稀疏，間隙增大，正常錐體神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，大部分細胞出現(xiàn)核固縮，細胞形態(tài)不一。姬松茸多肽干預后小鼠海馬錐體細胞形態(tài)基本保持正常，與模型組比較排列緊密，間隙減少，層次清晰，形狀體積均一。

2.8 姬松茸多肽對腦組織中Nrf2、NQO1、GCLM基因表達的影響

圖5 姬松茸多肽對Nrf2Nrf2、NQO1NQO1、GCLMGCLM基因表達的影響（n＝3）3Fig. 5 Effect of purified peptide extract from Agaricus blazei on the expression of Nrf2, NQO1 and GCLM genes (n = 3)

由圖5可知，與空白組相比，模型組小鼠腦組織Nrf2、NQO1、GCLMmRNA相對表達量顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，姬松茸多肽組小鼠腦組織中Nrf2mRNA相對表達量顯著增高（P＜0.05），誘導其下游靶基因NQO1、GCLMmRNA相對表達量顯著增高（P＜0.05）。進一步驗證有可能通過影響Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch-like epichlorohydrin-related protein 1，Keap1）/Nrf2/抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）信號通路中Nrf2、NQO1、GCLM表達而發(fā)揮相關(guān)作用。

3 討 論

姬松茸多肽是從姬松茸中提取的有效成分，許多動、植物蛋白中的多肽在體內(nèi)或體外釋放后均表現(xiàn)出生物活性，這些多肽除具有營養(yǎng)作用外，在體內(nèi)還具有一些生理功能，如抗菌、促進礦物質(zhì)吸收、增強免疫和抗氧化等[9]。本研究采用硫酸銨沉淀結(jié)合酶解法提取姬松茸活性多肽并通過葡聚糖凝膠進行純化，冷凍干燥后得到有活性的姬松茸多肽提取物。

自由基損傷學說是眾多科學家共識的衰老學說。D-gal誘導的衰老模型是目前較經(jīng)典的衰老動物模型，能夠阻斷大腦皮層、隔區(qū)、海馬區(qū)中受體的結(jié)合位點并且伴隨腦內(nèi)氧化應激狀態(tài)的改變，從而使自由基過量引起衰老[16-18]，接近于自然衰老規(guī)律。其具體機制在于可使生物體中產(chǎn)生大量ROS，導致細胞線粒體系統(tǒng)損傷，產(chǎn)生大量過氧化脂質(zhì)，同時ROS及其過氧化產(chǎn)物MDA水平升高，CAT等抗氧化酶活力下降，最終導致機體抗氧化水平降低甚至損傷，出現(xiàn)各種衰老變化[18-22]。本實驗結(jié)果提示，模型組小鼠毛發(fā)稀疏、狀態(tài)萎靡，并伴隨學習記憶力衰退、行為能力降低、反應遲緩等，具有明顯的衰老癥狀。而給予姬松茸多肽干預后，衰老小鼠運動和耐應激能力有所提高，血清T-AOC、CAT活力增強，并且能夠清除過剩ROS，降低脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生。且海馬區(qū)神經(jīng)細胞的結(jié)構(gòu)完整性好，出現(xiàn)退化固縮的細胞數(shù)量明顯減少，抗衰老作用明顯。

Nrf2作為細胞氧化應激反應的重要因子，可以在氧化應激中發(fā)揮核心調(diào)控作用，提高體內(nèi)的抗氧化能力，減輕細胞氧化損傷，增強對ROS的清除能力，延緩衰老[22-26]。當機體遭受氧化損傷時，Nrf2磷酸化進而與Keap1解偶聯(lián)，進入細胞核內(nèi)，隨后結(jié)合相關(guān)基因的ARE轉(zhuǎn)錄，并誘導其下游靶基因GCLM、NQO1表達，使其表達量降低[26-30]。本實驗結(jié)果中，與空白組相比，模型組小鼠腦組織中Nrf2、NQO1、GCLM mRNA相對表達量顯著降低，而給予姬松茸多肽后表達水平較模型組增高，表明姬松茸多肽抗衰老作用機制可能與Nrf2/ARE抗氧化信號通路有關(guān)。

綜上所述，姬松茸多肽提取物對D-gal誘導的衰老小鼠具有保護作用，該作用為開發(fā)姬松茸系列產(chǎn)品提供理論參考。