于蘭蘭，劉 偉，周雅琳，李 雍，秦 勇，李?，B，許雅君*

（北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，食品安全毒理學(xué)研究與評價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191）

含乙醇飲料在世界各地消費(fèi)廣泛，然而過量飲酒可能會(huì)導(dǎo)致一系列的健康問題，如酒精性肝炎、心臟病、神經(jīng)血管性炎癥等[1-2]。肝臟是人體新陳代謝及解毒的重要器官，過量飲酒引起的氧化應(yīng)激、促炎介質(zhì)及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡會(huì)加劇酒精性肝炎的進(jìn)展[3-4]。其中，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是許多疾病的潛在病理和生理核心，乙醇或其代謝產(chǎn)物可以通過增加人體內(nèi)的自由基或活性氧來降低機(jī)體抗氧化水平[5]；因此抗氧化劑是治療急性和慢性酒精中毒的良好策略[6]?？寡趸钚噪氖亲罱粡V泛研究的一類天然活性肽，其通過減少氧自由基、羥自由基和阻斷脂質(zhì)體氧化過程中的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而達(dá)到抗氧化、延緩衰老的作用[7]。本實(shí)驗(yàn)以小麥低聚肽為研究對象，將健康小鼠灌胃不同劑量小麥低聚肽30 d后，進(jìn)行急性酒精氧化損傷造模，觀察小鼠血清和肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化，旨在探討小麥低聚肽對急性酒精中毒誘導(dǎo)氧化損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清潔級健康雄性ICR小鼠，體質(zhì)量約25～30 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0010。動(dòng)物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（23±2）℃，相對濕度50%～60%，明暗交替12 h∶12 h。本研究實(shí)驗(yàn)方案通過北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批。

丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）、蛋白定量、蛋白質(zhì)羰基含量檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；無水乙醇（優(yōu)級純） 北京市通廣精細(xì)化工公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPN3001F電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；FLUOstar Omega多功能酶標(biāo)儀 德國BMG Labtech公司；BFX5-320型低溫自動(dòng)平衡離心機(jī) 中國白洋離心機(jī)廠；Allegra X-30臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)美國Beckman公司；HH S11-1電熱恒溫水浴鍋 上海華聯(lián)環(huán)境實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司恒昌儀器廠；紫外分光光度計(jì)上海第三分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 小麥低聚肽的提取

小麥低聚肽以小麥谷朊粉為原料，采用酶耦聯(lián)技術(shù)和多級分離技術(shù)，制備得到分子質(zhì)量集中在200～1 000 Da的小分子肽[8-9]。

主要工藝流程：小麥谷朊粉→調(diào)漿乳化→雙酶酶解→臥螺離心→滅酶→蒸發(fā)濃縮→滅菌→噴霧干燥→成品小麥低聚肽。

依據(jù)GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定》，采用氨基酸自動(dòng)分析儀對小麥低聚肽中的氨基酸組成進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。

表1 小麥低聚肽的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of wheat oligopeptides

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型建立

參照國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的抗氧化功能評價(jià)方法[10]，小鼠經(jīng)1 周適應(yīng)期后，按照體質(zhì)量將60 只小鼠隨機(jī)分為5 組，分別為空白對照組、模型組及小麥低聚肽低、中、高劑量組，每組12 只。各組均給予基礎(chǔ)飼料，自由進(jìn)食、飲用無菌去離子水。實(shí)驗(yàn)期間每日8∶00－10∶00，小麥低聚肽低、中、高劑量組小鼠分別灌胃0.4、0.8、1.6 g/kgmb小麥低聚肽水溶液，空白對照組和模型組小鼠灌胃等體積的蒸餾水，連續(xù)灌胃30 d。每6 d記錄小鼠體質(zhì)量和攝食量。

末次灌胃后，空白對照組小鼠不禁食禁水，模型組和小麥低聚肽低、中、高劑量組小鼠禁食不禁水16 h，第二天晨起按照12 mL/kgmb一次性灌胃體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液，造成小鼠急性酒精中毒。

1.3.3 指標(biāo)測定

灌胃體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液6 h后，各組動(dòng)物摘眼球取血后脫頸處死，收集各組小鼠血液，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液備用；取肝臟組織勻漿。按照試劑盒操作步驟測定小鼠血清和肝臟中GSH水平、T-SOD活力、MDA水平以及肝組織蛋白質(zhì)羰基和蛋白含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析比較組間差異，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。方差齊時(shí)，采用最小顯著性差異法進(jìn)行兩兩比較；方差不齊時(shí)，采用Tamhane’s T2法進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥低聚肽對小鼠體內(nèi)GSH水平的影響

圖1 小麥低聚肽對小鼠血清和肝臟GSH水平的影響Fig. 1 Effects of wheat oligopeptides on GSH levels in serum and liver of mice

由圖1可知，一次性灌胃體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液后，模型組小鼠血清和肝臟中GSH水平分別極顯著（P＜0.01）和顯著（P＜0.05）低于空白對照組，這表明急性酒精中毒誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生氧化損傷，導(dǎo)致小鼠肝臟和血清中抗氧化物質(zhì)GSH水平降低。與模型組比較，小麥低聚肽低劑量組小鼠血清中GSH質(zhì)量濃度顯著升高（P＜0.05），肝臟中GSH含量極顯著升高（P＜0.01）；小麥低聚肽中、高劑量組小鼠血清和肝臟中GSH水平與模型組差異不顯著。由此判定，低劑量的小麥低聚肽具有提高急性酒精中毒小鼠體內(nèi)抗氧化物質(zhì)GSH水平的作用。

2.2 小麥低聚肽對小鼠體內(nèi)T-SOD活力的影響

圖2 小麥低聚肽對小鼠血清和肝臟中T-SOD活力的影響Fig. 2 Effects of wheat oligopeptides on T-SOD activity in serum and liver of mice

由圖2可知，一次性灌胃體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液后，與空白對照組相比，模型組小鼠血清和肝臟中的T-SOD活力分別顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）低于空白對照組，表明急性酒精中毒誘導(dǎo)的小鼠氧化損傷降低了機(jī)體內(nèi)T-SOD活力。與模型組比較，僅小麥低聚肽低劑量組小鼠的血清T-SOD活力顯著提高（P＜0.05），而小麥低聚肽各劑量組小鼠的肝臟T-SOD活力均極顯著高于模型組（P＜0.01）。由此判定，小麥低聚肽，尤其是低劑量時(shí)，具有增強(qiáng)急性酒精中毒小鼠體內(nèi)T-SOD活力的作用。

2.3 小麥低聚肽對小鼠體內(nèi)MDA水平的影響

圖3 小麥低聚肽對小鼠血清和肝臟MDA水平的影響Fig. 3 Effects of wheat oligopeptides on MDA levels in serum and liver of mice

由圖3可知，一次性灌胃體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液后，與空白對照組相比，模型組小鼠血清MDA濃度增加，但不顯著，肝臟中MDA含量顯著增加（P＜0.05），表明急性酒精中毒誘導(dǎo)小鼠發(fā)生氧化損傷，促使小鼠體內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致小鼠血清和肝臟中MDA水平升高。與模型組相比，僅小麥低聚肽高劑量組小鼠血清MDA濃度顯著降低（P＜0.05）。由此判定，小麥低聚肽具有抑制脂質(zhì)過氧化的作用。

2.4 小麥低聚肽對小鼠肝臟蛋白質(zhì)羰基含量的影響

圖4 小麥低聚肽對小鼠肝臟蛋白質(zhì)羰基含量的影響Fig. 4 Effects of wheat oligopeptides on protein carbonyl content in liver of mice

由圖4可知，一次性灌胃體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液后，模型組小鼠肝臟中蛋白質(zhì)羰基含量極顯著高于空白對照組（P＜0.01），表明急性酒精中毒誘導(dǎo)的小鼠氧化損傷可破壞機(jī)體肝臟蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)羰基含量增加。小麥低聚肽低劑量組小鼠肝臟中的蛋白質(zhì)羰基含量顯著低于模型組（P＜0.05），中、高劑量組與模型組差異不顯著。由此判定，低劑量的小麥低聚肽具有抑制蛋白質(zhì)過氧化的作用。

綜上，根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理總局印發(fā)的抗氧化功能評價(jià)方法[10]中評價(jià)結(jié)果的判定原則，本實(shí)驗(yàn)中急性酒精中毒小鼠灌胃小麥低聚肽后，小鼠血清和肝臟脂質(zhì)過氧化物MDA水平、蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物蛋白質(zhì)羰基含量、抗氧化酶T-SOD活力、抗氧化物質(zhì)GSH水平4 項(xiàng)指標(biāo)均為陽性，可判定小麥低聚肽抗氧化動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為陽性。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過小麥低聚肽干預(yù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究其對急性酒精中毒造成小鼠氧化損傷的保護(hù)作用。本研究利用生長期健康小鼠，連續(xù)灌胃小麥低聚肽（0.4、0.8、1.6 g/kg mb）干預(yù)30 d，實(shí)驗(yàn)期內(nèi)各組小鼠體質(zhì)量和攝食量均沒有顯著差異，說明在本實(shí)驗(yàn)劑量下，受試物小麥低聚肽不會(huì)對小鼠的正常生長造成不良影響，沒有影響其對食物的正常利用，這為后續(xù)小鼠急性酒精中毒奠定基礎(chǔ)。

活性氧是生物系統(tǒng)在代謝過程中不斷自發(fā)生成的一種促氧化劑，包括超氧陰離子自由基、羥自由基、過氧化氫和一氧化氮[11]。適量的自由基為人體生命活動(dòng)和各組織細(xì)胞生長代謝所必需，而過量的活性氧自由基則會(huì)攻擊蛋白質(zhì)、多糖、核酸和多不飽和脂肪酸，導(dǎo)致細(xì)胞損傷及線粒體功能障礙[12]。過量活性氧積聚和自由基清除能力的下降是酒精性肝損傷的主要原因之一[13]。大量攝入乙醇時(shí)，乙醇在肝臟中的主要代謝產(chǎn)物乙醛激活氧分子產(chǎn)生自由基，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量活性氧，降低抗氧化系統(tǒng)水平，使機(jī)體內(nèi)自由基的生成和清除機(jī)制失衡，進(jìn)而損傷機(jī)體的大分子（脂肪、蛋白質(zhì)、DNA等），如脂質(zhì)過氧化、抗氧化酶系統(tǒng)失活、DNA突變以及細(xì)胞膜的破壞，最終導(dǎo)致整個(gè)細(xì)胞的損傷[14-16]。

抗氧化酶在乙醇、許多有毒物質(zhì)和活性氧的解毒過程中發(fā)揮重要作用。SOD是人類最重要的抗氧化酶之一。人體內(nèi)存在3 種SOD，其中SOD2是唯一被證明對氧化呼吸至關(guān)重要的抗氧化酶，線粒體內(nèi)生成的活性氧被SOD2還原為過氧化氫，而過氧化氫又被谷胱甘肽過氧化物酶或過氧化氫酶進(jìn)一步還原為水[17-18]。Kubota等[19]研究發(fā)現(xiàn)在喂食富含乙醇飼料的大鼠中，SOD2過表達(dá)可以減輕乙醇引起的肝損傷。有研究表明，在急性酗酒模型中，小鼠SOD2的高表達(dá)對肝臟具有保護(hù)作用[20]。GSH是一種具有重要生理功能的天然活性三肽分子，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，且在毒物、致癌物及藥物代謝的解毒方面具有重要作用。它可清除超氧陰離子自由基、H2O2、過氧化脂質(zhì)，穩(wěn)定含巰基的酶，防止血紅蛋白及其他輔助因子受氧化損傷，缺乏或耗竭GSH會(huì)促使許多化學(xué)物質(zhì)或環(huán)境因素產(chǎn)生毒性作用，因此GSH含量是衡量機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)[21-22]。本研究中，與模型組相比，小麥低聚肽低劑量組小鼠血清T-SOD活力、GSH質(zhì)量濃度顯著升高，肝臟T-SOD活力、GSH含量極顯著升高。這表明小麥低聚肽能通過升高抗氧化酶活性及抗氧化物質(zhì)含量，從而加強(qiáng)機(jī)體防御體系的抗氧化能力，防止急性酒精中毒引起的肝損傷。

蛋白質(zhì)羰基化是氨基酸殘基側(cè)鏈?zhǔn)艿窖踝杂苫糇詈筠D(zhuǎn)變成羰基產(chǎn)物，是氧化應(yīng)激中一種不可逆的化學(xué)修飾。蛋白質(zhì)羰基化參與多種疾病的生理病理過程，如蛋白質(zhì)羰基化啟動(dòng)凋亡的過程。蛋白質(zhì)羰基形成是多種氨基酸在蛋白質(zhì)氧化修飾過程中的早期標(biāo)志，蛋白質(zhì)羰基含量可直接反映蛋白質(zhì)損傷的程度[23]。機(jī)體內(nèi)存在著大量的不飽和脂肪酸，極易受到過氧化作用的損傷。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)鏈?zhǔn)浇K止階段產(chǎn)生的小分子產(chǎn)物，是目前公認(rèn)能反映氧自由基產(chǎn)生及引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的間接指標(biāo)，其含量可以間接反映自由基的產(chǎn)生情況和機(jī)體組織細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化程度[24]。本研究中，與模型組相比，小麥低聚肽低劑量組小鼠肝臟蛋白質(zhì)羰基含量顯著降低；小麥低聚肽高劑量組小鼠血清MDA濃度顯著降低。這表明，小麥低聚肽能降低自由基對肝臟蛋白的損傷程度，且對細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化有一定的減輕作用。

小麥低聚肽是小麥蛋白經(jīng)酶水解得到的結(jié)構(gòu)片段，其中谷氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。研究表明小麥低聚肽含有豐富的谷氨酰胺，可以作為谷氨酰胺的優(yōu)良補(bǔ)充劑[25]。谷氨酰胺被證明是GSH的主要前體物質(zhì)，這可能與小麥低聚肽發(fā)揮其抗氧化作用有關(guān)。肝臟對GSH的合成依賴于肝細(xì)胞內(nèi)的谷氨酸和谷氨酰胺。Schemitt等[26]研究發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺保護(hù)肝細(xì)胞的作用機(jī)制包括GSH的抗氧化作用，GSH依賴于谷氨酸的供應(yīng)，而谷氨酸又可以由谷氨酰胺酶水解谷氨酰胺產(chǎn)生。高濃度乙醇會(huì)導(dǎo)致GSH氧化還原循環(huán)失衡，導(dǎo)致肝損傷。本研究中，小麥低聚肽能夠提高急性酒精中毒小鼠肝臟組織中的GSH含量，顯示其具有肝臟保護(hù)作用。Gouvêa等[27]研究發(fā)現(xiàn)預(yù)先攝入谷氨酰胺可提高腎缺血再灌注大鼠的總抗氧化能力和GSH過氧化物酶水平。李松濤等[28]研究發(fā)現(xiàn)短期補(bǔ)充外源性谷氨酰胺可顯著提高大鼠血清SOD活力及降低MDA水平，表明谷氨酰胺具有一定的抗氧化作用。蛋白質(zhì)羰基化是蛋白質(zhì)損傷的重要標(biāo)志，與氧化應(yīng)激、疾病和衰老有關(guān)。脯氨酸、精氨酸等氨基酸側(cè)鏈?zhǔn)艿交钚匝踝杂苫魰?huì)形成蛋白質(zhì)衍生的羰基產(chǎn)物[29]。補(bǔ)充蛋白質(zhì)羰基化過程中損傷的特定蛋白質(zhì)或氨基酸，有利于減輕活性氧對機(jī)體重要蛋白的損傷。小麥低聚肽中含有的氨基酸可以直接被機(jī)體吸收并參與機(jī)體多種代謝反應(yīng)，這可能與小麥低聚肽降低自由基對蛋白質(zhì)的損傷有關(guān)。改變不良生活方式、攝入天然抗氧化劑或通過藥物降低氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物的含量通常被認(rèn)為是有益于健康的行為[30]。本研究結(jié)果表明，小麥低聚肽能提高急性酒精中毒小鼠體內(nèi)的抗氧化能力，并對急性酒精中毒小鼠肝損傷具有一定的緩解作用。本實(shí)驗(yàn)通過對植物活性肽小麥低聚肽的抗氧化功能進(jìn)行研究與分析，為功能性保健品的開發(fā)和利用提供了依據(jù)，但仍需要進(jìn)一步探尋小麥低聚肽抗氧化功能的組織病理及作用機(jī)制。