趙麗云，劉愛蓮，劉美玉,*，任曉鋒

（1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056038；2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

硫辛酸（lipoic acid，LA）是屬于B族維生素的一類雙硫代巰基化合物，存在于動(dòng)物肝臟組織及菠菜、番茄等植物中，是脂溶和水溶兩性分子，能以較高濃度存在于細(xì)胞內(nèi)外發(fā)揮作用。同時(shí)，它作為丙酮酸脫氫酶和甘氨酸脫羧酶的輔酶，是一種強(qiáng)有力的抗氧化劑[1]，可以影響細(xì)胞清除自由基的進(jìn)程，如增加谷胱甘肽（glutathione，GSH）的合成，調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子活性；LA也被用于通過金屬螯合治療重金屬中毒[1-2]以及由外界引起的氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞損傷，包括糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、感染、老化和電離輻射[3-4]。

白藜蘆醇（resveratrol，RES），又稱芪三酚[5]，是一種非黃酮類多羥基酚類化合物，主要來源于藜蘆、虎杖、藍(lán)莓、桑葚、葡萄等天然植物或果實(shí)中[6]，能清除并捕捉活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），并通過抑制二硫化GSH的形成，使GSH處于還原狀態(tài)，發(fā)揮抗氧化作用。目前在體內(nèi)[7]和體外[8-9]研究中，都證明RES自身具有抗氧化作用[10]，同時(shí)它作為一種重要的天然植物抗毒素，可以抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，降低血脂[11]，防治心血管疾病，并能延緩衰老的發(fā)生。目前，RES已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)。

對(duì)乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）是一種常見的解熱鎮(zhèn)痛藥物。然而，APAP過量可能導(dǎo)致嚴(yán)重的線粒體功能障礙和肝臟損傷[12]。APAP及其代謝物可引起細(xì)胞凋亡和線粒體氧化磷酸化，消耗ATP，引起選擇性線粒體氧化應(yīng)激，降低線粒體膜電位，增加Ca2+水平，改變膜滲透性，并釋放促凋亡因子，如caspase-3[13-14]。在西方國家，APAP引起的急性肝功能衰竭很常見[3]。因此，研究能夠有效預(yù)防或緩解APAP引起的急性肝損傷的抗氧化因子具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)通過建立HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激體外模型，比較LA和RES在APAP致HepG2細(xì)胞損傷中的抗氧化作用，并初步探討其抗氧化機(jī)制，為APAP所致肝損傷防治和功能食品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肝癌細(xì)胞株（HepG2）購自北京協(xié)和細(xì)胞庫。

DMEM培養(yǎng)基、血清 美國Gibco公司；胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、CCK-8、Annexin V-FITC/PI試劑盒、二抗、BCA定量蛋白試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；LA、APAP、RES、2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2’,7’-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）、2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2,2’-azobis[2-methylpropionamidine] dihydrochloride，ABAP） 美國Sigma公司；GSH、MDA、SOD試劑盒 南京建成生物工程研究所；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR熒光定量試劑盒 日本Takara公司；Bax、Bcl-2、caspase-3引物 生工生物工程（上海）股份有限公司；actin、Bax、Bcl-2、caspase-3一抗 美國Abcam公司。

1.2 儀器與設(shè)備

InfiniteM200PRO多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；CytoFLEXB3-R3-V2流式細(xì)胞儀 美國貝克曼庫爾特有限公司；LightCycler?96實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）儀瑞士Roche公司；GEAI600 RGB凝膠成像系統(tǒng) 美國通用電氣醫(yī)療公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為5% CO2、37 ℃、飽和濕度。待細(xì)胞濃度達(dá)到80%～90%時(shí)，用0.25%胰酶進(jìn)行消化，以細(xì)胞濃度1∶4比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)[15]。

1.3.2 APAP誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞肝損傷模型的建立

將HepG2細(xì)胞以1×104個(gè)/mL接種于96 孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h，細(xì)胞全部貼壁后，分別給予10、20、30、40、50、60 μmol/L濃度的APAP進(jìn)行造模（給藥組），對(duì)照組不加APAP，共孵育24 h后，加入CCK-8工作液，用多功能酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)細(xì)胞的存活率，每個(gè)濃度設(shè)5 個(gè)重復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 遍。選擇APAP的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）進(jìn)行后續(xù)研究[16-18]。細(xì)胞存活率按式（1）計(jì)算。

式中：A為給藥組吸光度；AC為對(duì)照組吸光度，A0為細(xì)胞培養(yǎng)基吸光度。

1.3.3 LA和RES對(duì)APAP誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞損傷的影響

將HepG2細(xì)胞以1×104個(gè)/mL接種于96 孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h，細(xì)胞全部貼壁后，給與APAP的同時(shí)，分別用20、60 μmol/L的LA和RES進(jìn)行干預(yù)，孵育24 h后，加入CCK-8工作液，用多功能酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)細(xì)胞的存活率，每個(gè)濃度設(shè)5 個(gè)重復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 遍。

1.3.4 Annexin-V FITC/PI雙標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將HepG2細(xì)胞以2×106個(gè)/mL接種到6 孔板中，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h細(xì)胞全部貼壁后，分別設(shè)對(duì)照組（僅加入細(xì)胞培養(yǎng)基）、模型組（加入60 μmol/L APAP）及給藥組（LA組（加入60 μmol/L APAP及20 μmol/L LA）、RES組（加入60 μmol/L APAP及20 μmol/L RES）），共孵育24 h后，將細(xì)胞消化，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞凋亡率按式（2）計(jì)算。

1.3.5 LA和RES的細(xì)胞抗氧化活性比較

將HepG2細(xì)胞以6×104個(gè)/mL接種于96 孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后，除去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗每個(gè)接種孔。然后每孔分別加入100 μL的樣品處理液（20、60 μmol/L的LA和RES）共孵育24 h后，用PBS清洗每個(gè)孔，各孔加入100 μL含有25 μmol/L的DCFH-DA混合液共孵育1 h，用PBS清洗每個(gè)孔，除去DCFH-DA，然后用60 μmol/L ABAP處理，將96 孔板放入多功能酶標(biāo)儀中進(jìn)行掃描，間隔5 min掃描一次，持續(xù)1 h。在538 nm波長(zhǎng)處測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)物的熒光值。繪制LA和RES的細(xì)胞抗氧化動(dòng)力學(xué)曲線[19-21]。

1.3.6 血清中MDA含量及GSH質(zhì)量濃度、SOD活力檢測(cè)

將HepG2細(xì)胞以2×106個(gè)/mL接種到6 孔板中，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h細(xì)胞全部貼壁后，分組同1.3.4節(jié)，共孵育24 h后，將細(xì)胞消化后用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞中MDA含量及GSH質(zhì)量濃度、SOD活力。

1.3.7 逆轉(zhuǎn)錄qPCR檢測(cè)Bcl-2、Bax和caspase-3 mRNA表達(dá)

將HepG2細(xì)胞以2×106個(gè)/mL接種到6 孔板中，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h細(xì)胞全部貼壁后，分別設(shè)對(duì)照組、模型組及給藥組（LA組、RES組），共孵育24 h后，將細(xì)胞消化后用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以β-actin為內(nèi)參，用qPCR儀檢測(cè)細(xì)胞中Bcl-2、Bax和caspase-3 mRNA的表達(dá)量[22]。

1.3.8 Western blot檢測(cè)Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達(dá)

將HepG2細(xì)胞以2×106個(gè)/mL接種到6 孔板中，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h細(xì)胞全部貼壁后，分組同1.3.4節(jié)，共孵育24 h后，將細(xì)胞消化后用RAPI裂解液提取細(xì)胞總蛋白，以β-actin為內(nèi)參，凝膠成像儀檢測(cè)細(xì)胞中Bcl-2、Bax和caspase-3 mRNA的表達(dá)量[23]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組之間比較采用T-test法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 APAP誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞肝損傷模型的建立

圖1 APAP對(duì)HepG2細(xì)胞活性的影響Fig. 1 Effect of APAP on cell viability of HepG2 cells

如圖1所示，隨著APAP濃度增加，HepG2細(xì)胞的存活率逐漸降低，APAP的IC50為60 μmol/L，選擇該濃度造模進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 LA和RES對(duì)APAP誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞損傷的影響

首先測(cè)定了LA和RES對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性影響，發(fā)現(xiàn)LA對(duì)細(xì)胞無影響的安全濃度為0～60 μmol/L（圖2）；RES對(duì)細(xì)胞無影響的安全濃度為0～90 μmol/L（圖3）。用20、60 μmol/L的LA和RES分別對(duì)模型組細(xì)胞處理24 h后，結(jié)果顯示LA和RES均能提高細(xì)胞活力，且LA組細(xì)胞活力較RES組高，尤以20 μmol/L LA組效果最佳（圖4）。

圖2 LA對(duì)HepG2細(xì)胞活性的影響Fig. 2 Effect of LA on cell viability of HepG2 cells

圖3 RES對(duì)HepG2細(xì)胞活性的影響Fig. 3 Effect of RES on cell viability of HepG2 cells

圖4 LA和RES對(duì)APAP誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞損傷的影響Fig. 4 Effect of LA and RES on cell viability of APAP-induced HepG2 cells

通過LA和RES干預(yù)APAP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，可看到APAP（60 μmol/L）能明顯抑制HepG2細(xì)胞活性，用LA和RES進(jìn)行干預(yù)后，LA組細(xì)胞活力較比RES組高，其中20 μmol/L LA的藥效最佳，說明LA干預(yù)APAP誘導(dǎo)的損傷效果最好，可能原因是LA屬于高效抗氧化劑，其可清除ROS，再生GSH。

2.3 Annexin-V FITC/PI雙標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

圖5 LA和RES對(duì)APAP誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用Fig. 5 Protective effect of LA and RES on acetaminophen-induced apoptosis in HepG2 cells

如圖5所示，每個(gè)圖中左上Q1-UL代表壞死細(xì)胞，右上Q1-UR代表凋亡晚期細(xì)胞，左下Q1-LL代表正常細(xì)胞，右下Q1-LR代表早期凋亡細(xì)胞。

以PBS為對(duì)照，其凋亡率為12.48%（Q1-UR+Q1-LR）；模型組的細(xì)胞凋亡率為99.14%，與對(duì)照組相比細(xì)胞凋亡率明顯升高；RES組的細(xì)胞凋亡率為27.64%，LA組的細(xì)胞凋亡率為21.69%，二者與模型組比較細(xì)胞凋亡率均明顯降低。LA組凋亡率降低值明顯低于RES組凋亡率降低值。由此可見，RES和LA均可抑制氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡，且LA的效果優(yōu)于RES。

2.4 LA和RES的細(xì)胞抗氧化活性比較

HepG2細(xì)胞內(nèi)的ABAP產(chǎn)生的ROS會(huì)將DCFH-DA氧化成有熒光的二氯熒光（dichlorofluorescein，DCF），熒光強(qiáng)度高[22]。從圖6可看出，不同濃度的LA和RES作為抗氧化劑抑制了該反應(yīng)的進(jìn)行，熒光強(qiáng)度減?。磺蚁嗤瑵舛认?，LA組比RES組熒光強(qiáng)度小，說明LA抑制DCF的生成的能力比RES強(qiáng)。

圖6 LA和RES的細(xì)胞抗氧化動(dòng)力學(xué)曲線Fig. 6 Cellular antioxidant kinetic curves of LA and RES

2.5 LA和RES對(duì)APAP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中MDA、GSH及SOD水平的影響

表1 LA和RES對(duì)APAP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中MDA、SOD、GSH水平的影響Table 1 Effect of LA and RES on MDA, SOD and GSH levels in HepG2 cells induced by APAP

如表1所示，與對(duì)照組相比，模型組MDA含量高度顯著升高，而GSH質(zhì)量濃度和SOD活力高度顯著降低；與模型組相比，LA組和RES組均可高度顯著降低MDA含量，同時(shí)高度顯著提高GSH質(zhì)量濃度和SOD活力，而LA比RES效果好。

氧化應(yīng)激可導(dǎo)致ROS在細(xì)胞內(nèi)的累積，若超過細(xì)胞的抗氧化能力時(shí)，則會(huì)引起細(xì)胞的損傷或凋亡，從而影響細(xì)胞的正常的結(jié)構(gòu)和功能，此時(shí)機(jī)體自身的抗氧化防御系統(tǒng)將會(huì)發(fā)揮作用。生物體抗氧化的強(qiáng)度及效果可以通過測(cè)定血清中的酯質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量、SOD活力和GSH質(zhì)量濃度變化來確定。GSH是生物體內(nèi)絕大多數(shù)細(xì)胞中巰基的主要來源，其中在肝細(xì)胞中可達(dá)95%以上，是機(jī)體抗自由基的主要成分，在維持機(jī)體氧化還原平衡中起著很重要的作用[24-26]；SOD是一種能夠催化超氧化物通過歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為氧氣和過氧化氫的酶，是判斷細(xì)胞損傷程度的相關(guān)指標(biāo)；MDA含量間接反映出細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，LA和RES兩組抗氧化指標(biāo)MDA含量均高度顯著降低，GSH質(zhì)量濃度和SOD活力均高度顯著提高，但LA比RES效果更明顯，這表明LA和RES均可通過減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)達(dá)到抑制APAP誘導(dǎo)的肝損傷作用，且LA的作用更強(qiáng)。

2.6 LA和RES對(duì)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax和caspase-3表達(dá)的影響

圖7 APAP誘導(dǎo)24 h 后 BBaaxx、BBccll--22和caspaassee--33的相對(duì)表達(dá)量Fig. 7 Relative Bax, Bcl-2 and caspase-3 expression after APAP induction for 24 h

圖8 LA和RES治療24 h后Bax Bcl-2 caspase-3的相對(duì)表達(dá)量Fig. 8 Relative Bax, Bcl-2 and caspase-3 expression after LA or RES treatment for 24 h

圖9 LA和RES處理24 h后Bax、Bcl-2和caspase-3的蛋白質(zhì)印跡電泳圖Fig. 9 Western blot analysis of Bax, Bcl-2 and caspase-3 after LA or RES treatment for 24 h

過量的APAP會(huì)導(dǎo)致肝損傷，引起細(xì)胞凋亡。已知多種基因與細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路相關(guān)，其中Bax基因可促進(jìn)凋亡，而Bcl-2基因能抑制細(xì)胞凋亡[27]，Bax通過抑制Bcl-2的活力誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[28]。caspase-3是激活線粒體凋亡信號(hào)通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此是凋亡發(fā)生的標(biāo)志酶[29]。

qPCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型組Bax和caspase-3表達(dá)量高度顯著提高，同時(shí)Bcl-2表達(dá)量高度顯著降低（圖7）；與模型組相比，LA組和RES組Bax和caspase-3表達(dá)量均有降低，同時(shí)Bcl-2表達(dá)量均有提高，但LA組比RES組效果更顯著，表明LA比RES具有更好的抑制HepG2細(xì)胞凋亡的作用（圖8）；Western blot結(jié)果也發(fā)現(xiàn)有同樣的趨勢(shì)，首先LA和RES可以從蛋白水平調(diào)節(jié)APAP誘導(dǎo)的損傷，其次LA比RES能更有效緩解APAP誘導(dǎo)的損傷（圖9）。

qPCR和Western blot結(jié)果均表明LA和RES均通過上調(diào)Bcl-2表達(dá)量、下調(diào)Bax和caspase-3表達(dá)量抑制APAP引起的細(xì)胞凋亡抑制APAP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，且LA比RES抑制效果更明顯。

3 結(jié) 論

本研究通過用60 μmol/L的APAP處理HepG2細(xì)胞，建立了HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激體外模型，并探討了兩種抗氧化物質(zhì)LA和RES對(duì)APAP致HepG2細(xì)胞損傷中的抗氧化作用。LA和RES均可提高對(duì)APAP所致的氧化損傷細(xì)胞活力，且LA比RES效果更顯著；LA抑制DCF的生成的能力比RES強(qiáng)；LA和RES均可抑制氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡，且LA組比RES組抑制細(xì)胞增殖效果更明顯，且LA比RES更有效地被細(xì)胞吸收發(fā)揮應(yīng)有的效用；另外，LA和RES是通過上調(diào)Bcl-2表達(dá)量、下調(diào)Bax和caspase-3表達(dá)量來抑制APAP引起的細(xì)胞凋亡，且LA比RES抑制效果更明顯。

綜上所述，LA比RES對(duì)APAP引起的肝損傷起到保護(hù)作用明顯，并且初步探討出LA和RES對(duì)APAP引起肝損傷保護(hù)作用機(jī)制，是通過抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡（通過降低MDA含量，提高GSH和SOD活力，下調(diào)Bax和caspase-3表達(dá)量及上調(diào)Bcl-2表達(dá)量）來實(shí)現(xiàn)其對(duì)APAP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。并且LA比RES干預(yù)APAP引起的細(xì)胞損傷效果更好。因此LA和RES對(duì)APAP引起肝損傷保護(hù)作用及其機(jī)制有待于更多基礎(chǔ)和臨床實(shí)驗(yàn)的證實(shí)。