馬淑慧，徐進(jìn)

（河南省信陽市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科免疫室，河南 信陽 464000）

急性心肌梗死其基礎(chǔ)病變通常為冠狀動脈粥樣斑塊形成,在動脈粥樣斑塊形成過程中反復(fù)發(fā)生血栓形成、心肌細(xì)胞缺氧缺血損傷病理改變，最終導(dǎo)致冠脈完全阻塞發(fā)生心肌缺血壞死[1]。目前評估心肌損傷的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)有傳統(tǒng)血清學(xué)標(biāo)志物如血清肌紅蛋白、肌酸激酶 （CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）、心肌肌鈣蛋白（cT-nI/T）等，都是急性心肌梗死患者心肌損傷標(biāo)志物,尤其是cTnI/T的使用被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)[2-4]。這些標(biāo)志物均有其局限，如特異度低、在慢性腎病與充血性心力衰竭患者中也有高表達(dá)等。近來有研究報道，miRNAs在急性心肌梗死患者血內(nèi)表達(dá)明顯升高,有望成為急性心肌梗死新型標(biāo)志物[5]。miR-12 6-5p能夠通過對內(nèi)皮細(xì)胞活化與白細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的調(diào)控影響血管內(nèi)皮功能,可能參與了急性心肌梗死的心肌損傷過程[6]。本研究觀察急性心肌梗死患者外周血miR-126-5p及各主要心肌損傷標(biāo)志物表達(dá)情況，分析患者外周血miR-126-5p表達(dá)與其心肌損傷的相關(guān)性,為未來急性心肌梗死患者心肌損傷的早期評估與治療提供新的標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 納入對象 選擇2018年2月至2019年8月期間我院收治的31例急性心肌梗死患者，為心肌梗死組；不穩(wěn)定性心絞痛患者30例,為不穩(wěn)定性心絞痛組；穩(wěn)定性心絞痛患者30例,為穩(wěn)定性心絞痛組；接受健康檢查的35例健康人,為健康對照組。急性心肌梗死患者符合 《急性心肌梗死診斷和治療指南》[7]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；穩(wěn)定型心絞痛患者符合《慢性穩(wěn)定型心絞痛診斷和治療指南》[8]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；不穩(wěn)定型心絞痛患者符合《不穩(wěn)定性心絞痛和非ST段抬高心肌梗死診斷與治療指南》[9]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。健康對照組人群均為既往無心血管病史且經(jīng)健康體檢證實(shí)為身體健康的人群。排除：⑴既往有心肌病、心力衰竭、急性心肌梗死、高血壓性心臟病、肥厚性心臟病等心臟病病史者；⑵合并肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤疾病者；⑶合并慢性或急性腎功能不全者；⑷既往接受腎臟移植替代治療者；⑸近期內(nèi)有外傷史、出血史與重大手術(shù)治療史者；⑹合并自身免疫性疾病、骨骼肌損傷等患者；⑺合并肺部慢性疾病或身體嚴(yán)重感染者。本研究的實(shí)施獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意，并簽署知情同意書。

1.2 一般資料 急性心肌梗死組患者男性19例，女性 12 例；年齡 40～70 歲,平均（58.25±5.12）歲；體質(zhì)量 44～85kg，平均（60.24±8.59）kg。 不穩(wěn)定性心絞痛組男性 18例,女性 12例；年齡 41～70歲,平均（59.11±6.02）歲；體質(zhì)量 45～85kg，平均（61.02±8.61）kg。穩(wěn)定型心絞痛組男性17例，女性13例；年齡 40～72 歲,平均（60.01±5.17）;體質(zhì)量 44～86kg，平均（61.59±8.71）kg。 健康對照組男性 21例，女性14 例；年齡 39～71 歲，平均（59.69±5.45）歲；體質(zhì)量45～84kg，平均（60.32±7.17）kg。 4 組納入者性別、年齡、體質(zhì)量等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.3 主要儀器與試劑 CK、CK-MB、LDH、cTnI試劑盒生產(chǎn)商為貝克曼庫爾特公司。乙二胺四乙酸(EDTA)生產(chǎn)商為Sigma-aldrich公司、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒生產(chǎn)商為Takara公司、DEPC生產(chǎn)商為賽默飛世爾科技有限公司;生化儀生產(chǎn)商為貝克曼庫爾特公司、免疫測定儀生產(chǎn)商為貝克曼庫爾特公司；總RNA提取試劑（Trizol）生產(chǎn)商為青島捷世康生物科技有限公司;線蟲cel-mir-39生產(chǎn)商為英國biorbyt；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ生產(chǎn)商為日本Takara公司；實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)儀生產(chǎn)商為美國Bio-rad公司。

1.4 測定方法

1.4.1 心肌損傷血清標(biāo)志物含量測定 采集入組者晨起時空腹?fàn)顟B(tài)下外周靜脈血,采集1管5mL血樣本至抗凝管內(nèi)，1份5min血樣本至干燥管（非抗凝管）內(nèi)，抗凝管內(nèi)血樣本經(jīng)處理得到血漿，非抗凝管內(nèi)樣本經(jīng)處理得到血清。采用酶法檢測CK、CK-MB、LDH水平。血清cTnI含量采用免疫比濁法測定。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4.2 外周血miR-126-5p表達(dá)測定 ⑴血漿microRNA的提?。合蜓獫{(250μl)內(nèi)加入TRIzol 750 μl,振蕩混勻保證蛋白復(fù)合物被完全解離，振蕩前各樣品內(nèi)加入線蟲cel-mir-39 50pm作為內(nèi)部參照。混合物內(nèi)加入氯仿200μl，充分振蕩室溫下靜置 10min，在 12000r/min、4℃，離心 10min，離心后取上清液,將離心后所得全部上清液(多少體積？)轉(zhuǎn)移至新的裝有3μl糖原+600μl異丙醇的試管內(nèi)。將混合的溶液置于零下20℃條件下過夜。12000r/min、4℃離心10min，棄上清，用95%酒精溶液反復(fù)清洗沉淀物，后加入DEPC 10μl混勻備用。⑵測定血漿microRNA濃度:取1μl RNA樣品，核酸蛋白分析儀檢測RNA濃度,測量并記錄A260，A260/A280，RNA濃度,對測量異常過高或過低的，再次測量并核對，剔除異常值，其他樣本存儲在-80℃環(huán)境下待檢（進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄）。⑶多聚腺苷酸化及逆轉(zhuǎn)錄。⑷microRNA定量檢測：配備20μl反應(yīng)體系,反應(yīng)體系的配備：7.2μl ddH2O，10μl SYBR （Mir-XTM miRNA First-Strand Synthesis Kit） （2X），0.4μl miRNA特異性引物的3，引物，0.4μl輔酶Q引物和2.0μl cDNA。使用實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)儀進(jìn)行miR-126-5p相對表達(dá)水平測定,聚合酶鏈反應(yīng)條件：預(yù)變性：95℃，10s，1次循環(huán)；聚合酶鏈反應(yīng)：95℃，10s，60℃，20s，39 次循環(huán)； 溶解：95℃，15s，60℃，60s，95℃，15s，1 次循環(huán)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本文數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0軟件檢測分析，采用“χ2”檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)，用“[n（%）]”表示計(jì)數(shù)資料，使用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差“（x±s）”表示計(jì)量資料（全部數(shù)據(jù)均經(jīng)正態(tài)分布檢驗(yàn)），外周血miR126-5p相對表達(dá)與各心肌損傷標(biāo)志物水平的相關(guān)性，采用雙變量Pearson直線相關(guān)檢驗(yàn)，P＜0.05為兩組數(shù)據(jù)對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組血清CK、CK-MB、LDH、cTnI水平比較 4組中,血清 CK、CK-MB、LDH、cTnI水平由低至高依次為健康對照組人群、穩(wěn)定性心絞痛組、不穩(wěn)定性心絞痛組、急性心肌梗死組，健康對照組與穩(wěn)定性心絞痛組各指標(biāo)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；其他各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見表 1。

表 1 4 組血清 CK、CK-MB、LDH、cTnI水平比較（x±s）

2.2 4組血清miR-126-5p相對表達(dá)比較 4組中，血清miR-126-5p相對表達(dá)由低至高依次為健康對照組人群、穩(wěn)定性心絞痛組、不穩(wěn)定性心絞痛組、急性心肌梗死組，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見表 2。

表2 4組血清miR-126-5p相對表達(dá)比較

2.3 外周血miR-126-5P相關(guān)表達(dá)與心肌損傷各標(biāo)志物水平相關(guān)性分析 經(jīng)雙變量Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,急性心肌梗死患者外周血miR-126-5p相對表達(dá)與患者血清各心肌損傷標(biāo)志物水平均呈顯著正相關(guān)（r＞0，P＜0.05）。 提示外周血 miR-126-5p表達(dá)量可反映患者心肌損傷的程度。見表3。

表3 外周血miR-126-5P相關(guān)表達(dá)與心肌損傷各標(biāo)志物水平相關(guān)性分析

3 討論

在發(fā)生缺氧缺血損傷時,心肌細(xì)胞內(nèi)酶與相關(guān)結(jié)構(gòu)分子會釋放到血液循環(huán)中,成為可以反映心肌損傷程度評估的標(biāo)志物。CK、LDH、AST等是廣泛存在于心肌、骨骼肌細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中，在一定程度上可以用于判斷心肌損傷程度,但其特異性相對較差[12]。CK-MB與cTnI二者是心肌細(xì)胞重要分子,用于評估機(jī)體心肌損傷有著較好的特異度[13]。CK-MB是催化酶的一類,參與了心肌細(xì)胞的能量代謝；cTnI則是結(jié)構(gòu)分子，是確保心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性的重要蛋白[14,15]。臨床應(yīng)用顯示，測定上述心肌損傷標(biāo)志物的水平可用于評價心肌損傷程度。本研究分析了健康對照者、冠心病不同病情發(fā)展者與急性心肌梗死患者發(fā)病期間心肌損傷血清學(xué)標(biāo)志物水平表達(dá),結(jié)果隨心肌缺血損傷嚴(yán)重程度升高，CK、CK-MB、LDH、cTnI血清水平表達(dá)明顯升高。

圖1 健康對照組cTnI正態(tài)性檢驗(yàn)Q-Q圖

近幾年，隨著多組學(xué)研究的飛速發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了眾多新疾病分子生物標(biāo)志物。miRNAs是一類單鏈的、短的、非編碼蛋白RNA分子，經(jīng)部分互補(bǔ)匹配至目的靶點(diǎn)3′非編碼區(qū),來調(diào)節(jié)基因水平表達(dá)[18]。許多miRNAs已經(jīng)被證實(shí)在細(xì)胞周期增殖、調(diào)控、存活、分化、轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要作用。有研究證實(shí)，miR-126-5p通過對內(nèi)皮細(xì)胞活化與白細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的調(diào)控影響血管內(nèi)皮功能,可能參與了急性心肌梗死的心肌損傷過程[19]，急性心肌梗死患者的心肌損傷可能與miRNAs存在一定聯(lián)系。有研究報道，急性心肌梗死患者miR-126-5p表達(dá)水平較健康人群顯著升高,與疾病之間表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性[20]。本研究結(jié)果顯示，4組中健康對照組外周血miR-126-5p相對表達(dá)最低，心肌缺血患者隨病情嚴(yán)重程度上升，miR-126-5p血水平越來越高，以急性心肌梗死組最顯著，且miR-126-5p相對表達(dá)水平與血液中上述心肌損傷標(biāo)志物均呈正相關(guān)。提示外周血miR-126-5p表達(dá)的異常升高與心肌缺血損傷的嚴(yán)重程度相關(guān)；miR-126-5p表達(dá)可能作為一種新的標(biāo)志物用于評估急性心肌梗死患者心肌損傷程度。本研究納入樣本量相對較小，結(jié)論可靠性還應(yīng)在未來進(jìn)一步展開大樣本的研究加以驗(yàn)證。

綜上所述,急性心肌梗死患者外周血miR-126-5p表達(dá)與其心肌損傷明顯相關(guān),在臨床診療實(shí)踐中可考慮將miR-126-5p表達(dá)用于評估和預(yù)測冠心病患者心肌損傷程度。