鄭恩惠 ，林杰 ，柯自立 ，謝芳欽 ，徐海濱

（1.福建省疾病預防控制中心，福建 福州 350001;2.福建省人獸共患病研究重點實驗室，福建 福州 350001）

致瀉性大腸埃希菌（iarrheagenic E coli，DEC）是引發(fā)感染性腹瀉常見的的腸道致病菌,根據(jù)其所攜帶的毒力因子、致病機制及流行病學特征等通常分為5類:腸致病性大腸埃希菌(EPEC)、腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌(ETEC)、腸出血性大腸埃希菌(EHE C)、腸侵襲性大腸埃希菌(EIEC)和腸聚集性大腸埃希菌(EAEC)[1]。

DEC引發(fā)的腹瀉病是全世界范圍內(nèi)備受關(guān)注的一個公共衛(wèi)生問題,特別是在發(fā)展中國家，DEC是引起嬰幼兒腹瀉的一種主要致病菌[2]，在臨床診斷難以鑒別,并且容易獲得耐藥基因。所以，能快速檢出DEC,并指導臨床經(jīng)驗性用藥具有重要意義。為此我省開展對致瀉大腸埃希菌的病原學監(jiān)測,以掌握其流行情況及耐藥性特征。

1 材料與方法

1.1 菌株 2018年從福建省南平市延平區(qū)和福建省永安市兩個監(jiān)測哨點分離的初步鑒定為大腸埃希菌的菌株共300株。參考菌株：EAEC、O157:H7 EDL933、EIEC、EPEC、ETEC、 ATCC 25922 為本實驗室保存的菌種。

1.2 試劑和儀器 五種致瀉大腸埃希菌多重熒光PCR檢測試劑盒 （深圳市生科原技術(shù)有限公司）。rTaq DNA,聚合酶dNTPs購自大連寶生物工程有限公司，瓊脂糖為BioAsia進口分裝品,PCR擴增儀為 G-Storm（英國 Gene Technologies公司）,實時熒光定量PCR儀為CorbettRotor-Gene6000，凝膠成像分析系統(tǒng)為Molecular Imager Gel Doc XR System（美國Bio-Rad公司）,電泳儀為北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-6C型。

1.3 方法

1.3.1 模板制備 將分離的菌株在普通營養(yǎng)瓊脂上37℃，培養(yǎng)18h～24h，刮取接種環(huán)一滿環(huán)的菌量于100μl滅菌雙蒸水中混勻,煮沸 10min～15min,離心，取上清直接用于PCR擴增。

1.3.2 PCR操作方法 提取可疑菌落的DNA，運用多重實時熒光PCR進行初篩,篩查出陽性基因的標本挑取單克隆進行單重PCR方法進行確認。五種致瀉大腸桿菌的相關(guān)檢測基因有：EAEC的aggR,pic和 astA基因、ETEC的 elstb和 elt基因、EPEC的 escV和 bfp、EHEC的 stx基因、EIEC的ipaH和virA基因[3,4]。多重熒光及單重PCR的反應體系及擴增程序嚴格按照試劑盒操作說明書進行。單重PCR引物及擴增條件參見文獻[4]。

1.3.3 藥敏試驗 采用北京天壇的的15種抗生素紙片,包括阿米卡星(AK)、氨芐西林 (AMP)、氨芐西林/舒巴坦(AMS)、頭孢唑啉(CFZ)、頭孢吡肟(CEF)、頭孢哌酮(CFP)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢西丁(FOX)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢曲松(CRO)、環(huán)丙沙星（CP）、慶大霉素(GEN)、美羅培南(MER)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、復方新諾明（SXT）。結(jié)果判定根據(jù) CLSI指南(2018版）標準解釋,按CLSI推薦的ESBLs紙片篩選法和酶抑制劑增強紙片確證法標準測定大腸埃希菌中的產(chǎn)ESBLs株。

2 結(jié)果

2.1 致瀉性大腸埃希菌（DEC）檢測結(jié)果

2.1.1 DEC分離 從300例腹瀉糞便標本中通過多重熒光PCR方法篩查出致瀉大腸桿菌毒力基因陽性標本28例,這28例標本經(jīng)過單重PCR方法分離出致瀉性大腸桿菌20株。

2.1.2 DEC分型結(jié)果 2018年5-11月共收到腹瀉糞便標本300份,分離出20株致瀉性大腸桿菌，檢出率為6.67%株,其中7株aggr基因陽性，4株astA基因陽性,1株pic陽性,判定為EAEC；4株escV基因陽性，判定為aEPEC；3株estlb基因陽性，1株elt基因陽性,判定為ETEC;未分離出EHEC和EI EC,見表 1。

表1 2018年福建省監(jiān)測點DEC毒力基因分布情況

2.1.3 DEC的感染特征 6-9月為檢出高峰，共分離出19株；致瀉性大腸桿菌在5歲以下兒童和60歲以上老人中檢出率較高,兩個年齡組內(nèi)均分離出7株。

2.1.4 藥敏試驗 對20株分離株進行了15種常見抗菌藥物敏感性檢測。其中氨芐西林的耐藥率相對較高,為 55%;其次是頭孢唑啉,耐藥率為 40%;頭孢噻肟、頭孢曲松、復方新諾明耐藥率均為 30%，其余測試的抗菌藥物敏感性較高。見表2。

2.1.5 產(chǎn)ESBLs菌株 判定為ESBLs表型的大腸埃希氏菌共有6株,耐藥率為30%（6/20）,均為EA EC。對氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢曲松的耐藥率均高達100%，對復方新諾明的耐藥率為50%。

表2 20株DEC對15種抗菌藥物的藥敏結(jié)果（%）

3 討論

傳統(tǒng)大腸埃希菌的檢測與鑒定方法需通過一系列繁復的增菌，生化，血清鑒定等過程，且不能區(qū)分出是否為DEC。福建省近年來建立起多重普通PCR和多重實時熒光PCR方法來進行DEC毒力基因的初篩，胡安妥[5]建立多重實時熒光檢測方法檢測5種致瀉性大腸埃希氏菌,一次性鑒別出多種致瀉性大腸，PCR后無需再進行凝膠電泳，操作簡單、高特異性、低漏檢率使其在微生物檢測和分子分型診斷上有重要的地位和應用前景[6]。

2018年從福建省兩個監(jiān)測哨點中分離出20株單克隆陽性菌株,檢出率為6.67%,與近年來我省DEC檢出率相持平[7,8],張彥春等對北京順義區(qū)201 3-2016年腹瀉病例中DEC的檢測,分離率為7.91%,以ETEC為主[9]；劉文娟對山東煙臺市2014-20 17年腹瀉病患者中致瀉性大腸埃希菌的檢測，檢出率9.32%,以EAEC為主[10]。我省近年來以 EAEC為優(yōu)勢種群,其次是 aEPEC,其中原因與EAEC的檢出率相關(guān)。有文獻報道astA毒力基因可在細菌間轉(zhuǎn)移，不僅存在于 EAEC菌中，也存在于EPEC、ETEC等其他致病性大腸埃希氏菌中，當與其他毒力基因同時檢出，astA基因不作為型別判定依據(jù)[11,12]，也有同行[13]認為僅檢出astA基因時可判定為EAE C。雖然astA的判定仍存在爭議，在本次實驗中，根據(jù)購買的PCR試劑盒使用說明書，將僅astA毒力陽性菌株暫時判定為EAEC,在本文中相較于aggR，pic，astA基因均陽性的典型EAEC,把僅astA陽性歸為非典型的EAEC，有利于進一步檢測其他相關(guān)基因。過去采用普通PCR分離出ast基因條帶位置與引物二聚體的位置十分接近而被誤判漏檢,現(xiàn)采用熒光PCR對ast基因直接判定，提高EAEC的檢出率?？倷z出率相對其他某些省份偏低，可能原因是監(jiān)測哨點樣本采集大多來自醫(yī)院和衛(wèi)生院，病人就診前已服用藥物。另外與當?shù)亟?jīng)濟，環(huán)境衛(wèi)生條件、飲食習慣相關(guān)。

本文研究數(shù)據(jù)顯示，DEC具有明顯的季節(jié)性流行特征，6-9月份為檢出高峰，5歲以下兒童和60歲以上老人為DEC的易感人群，與腸道腹瀉病傳染的流行規(guī)律相吻合。DEC在5歲以下兒童急性腸道感染的病原中占有重要地位。主要引起腸炎、出血性結(jié)腸炎和溶血性尿毒癥綜合征等[12]，故應加強對易感人群的預防工作，做好相關(guān)疾病防控。

藥敏結(jié)果顯示DEC對青霉素類、磺胺類及三代頭孢菌素類等藥物均表現(xiàn)出較強的耐藥率，對碳青霉烯類、氨基糖苷類藥物敏感。與往年福建省數(shù)據(jù)相比較耐藥模式差別不大,但多重耐藥菌明顯增多[14]。產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌是由質(zhì)粒介導，使耐藥基因在細菌之間傳遞造成耐藥菌株的流行[15]，隨著廣譜抗菌藥物廣泛應用,致瀉性大腸桿菌的多重耐藥現(xiàn)象日趨嚴重，在臨床上要加大重視，加強病原學與耐藥的監(jiān)測，為臨床合理用藥提供依據(jù)，減少耐藥菌的產(chǎn)生與播散。