許賀春，成守金，王中良

（焦作煤業(yè)（集團）有限責任公司中央醫(yī)院，1.檢驗科；2.消化內(nèi)科，河南 焦作 454000）

前列腺癌（Prostate cancer，PC）是發(fā)生于男性前列腺的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。目前，PC的診斷主要依靠直腸指診、血清前列腺特異抗原（Prostate specific antigen，PSA）、盆腔 MR I檢查等[2]。PSA是由前列腺上皮細胞分泌產(chǎn)生的一種具有組織特異性的絲氨酸蛋白酶，是PC的特異性標志物，但無腫瘤特異性，在良性前列腺增生和前列腺炎中其水平也會升高[3]。尋找新的特異性高的腫瘤標志物進行聯(lián)合診斷對提高PC的早期檢出率具有重要意義。miR-27a是前列腺集群調(diào)控反饋機制中的關鍵調(diào)控因子,可以調(diào)控前列腺癌的惡性生物學行為,促進腫瘤細胞的侵襲和遷移[4]。miR-29b是miR-29家族的一員，可以靶向調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡等相關基因的表達，參與多種腫瘤包括前列腺癌的發(fā)生發(fā)展[5]。因此，本研究檢測了PC患者外周血中miR-27a、miR-29b和PSA的表達，分析了其聯(lián)合檢測在PC診斷中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集2016年12月至2018年12月在本院確診的94例初診PC患者的血清標本。納入標準：均經(jīng)病理組織學確診，獲得患者及其家屬知情同意,通過本院醫(yī)學倫理會批準。排除標準：合并嚴重免疫系統(tǒng)或血液系統(tǒng)疾??；合并嚴重心、腦、肝、腎等臟器功能不全者；合并其他部位的原發(fā)腫瘤。94例PC患者，年齡40～80歲，平均年齡（56.66±9.37）歲，根據(jù)臨床病理分級：G1期 20 例，Gleason評分為 2～4分，G2期 28例，Gleason評分5～6分，G3期 46例，Gleason評分 7～10分；根據(jù)臨床TNM分期：Ⅰ期30例，Ⅱ期38例，Ⅲ期11例，Ⅳ期15例。收集同期47例前列腺增生（Benign Prostatic Hyperplasia，BPH)患者的血清標本為BPH組，年齡 40～80 歲，平均年齡（55.84±8.72）歲。 收集同期47例健康體檢者的血清標本為對照組，年齡40～80 歲，平均年齡（56.24±9.18）歲。三組一般資料差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

1.2 材料與儀器 Trizol總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒購自上海康朗生物科技有限公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；7500 RT-PCR系統(tǒng)購自于美國Applied Biosystems；羅氏Elecsys E170電化學發(fā)光儀及配套試劑購自羅氏公司。

1.3 觀測指標 所有納入研究對象于清晨采集空腹靜脈血3ml,3500rpm離心10min,分離上清。采用RT-PCR測定各組血清樣本中miR-27a和miR-29b的表達水平，采用Trizol試劑提取樣本的總RNA，用紫外分光光度儀測定RNA OD值，確定RNA濃度，將其稀釋到終濃度為1μg/μL，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，參考已有文獻和研究[6,7]，設計反應引物、條件和體系。miR-27a引物：正向5'-GGGTAGCACCATTTGAAATC-3'，反向 5'-TTTGGCACTAGCACATT-3'；miR-29b 引物：正向5'-GGCTTAGCTGCTTGTGAGCA-3'，反向5'-GCGGAACTTAGCCACTGTGA-3'，進行實時定量PCR反應，以GAPDH作為內(nèi)參，采用循環(huán)閾值（Ct值）表示cDNA達到指數(shù)擴增所需的循環(huán)數(shù),計算△Ct值=目的基因Ct值-參照基因Ct值，將△Ct值轉(zhuǎn)化為表達量進行比較。采用羅氏Elecsys E170電化學發(fā)光儀及配套試劑檢測總前列腺特異抗原（tPSA）、游離前列腺特異抗原（fPSA）以及fPSA與tPSA的比值（f/tPSA）。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，計量資料均以均數(shù)±標準差(x±s)表示，對計量資料首先進行正態(tài)性檢驗,如果各組均滿足正態(tài)性且兩組間方差齊,采用單因素方差分析比較組間差異性;若以上條件不滿足則考慮非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗，且差異均以P＜0.05表示具有統(tǒng)計學意義。采用ROC分析miR-27a、miR-29b聯(lián)合PSA診斷PC的價值，曲線下面積（AUC）表示診斷價值。

2 結(jié)果

2.1 miR-27a、miR-29b在PC患者外周血中的表達 與對照組相比，BPH和PC患者外周血中miR-27a mRNA的表達量顯著上調(diào) （P＜0.05），miR-29b mRNA的表達量顯著下調(diào)（P＜0.05）；與 BPH組相比，PC患者外周血中miR-27a mRNA的表達量顯著上調(diào)（P＜0.05），miR-29b mRNA 的表達量顯著下調(diào)（P＜0.05），見表 1。

表1 miR-27a、miR-29b在PC患者外周血中的含量（x±s）

2.2 PSA在PC患者外周血中的表達 與對照組相比，BPH和PC患者外周血中tPSA和fPSA的水平顯著升高(P<0.05),f/tPSA的水平顯著下降(P<0.05);與BPH組相比，PC患者外周血中tPSA和fPSA的水平顯著升高（P<0.05），f/tPSA的水平顯著下降（P<0.05），見表 2。

表2 前列腺癌患者PSA血液中含量（x±s）

2.3 miR-27a、miR-29b、PSA 在 PC 中的診斷價值ROC 分析顯示，miR-27a、miR-29b、tPSA、f/tPSA、tPSA聯(lián)合f/tPSA以及三者聯(lián)合診斷PC的AUC依次為 (0.816±0.032)、(0.792±0.032)、(0.837±0.027)、(0.833±0.027)、(0.882±0.022)、(0.958±0.013)，且三者聯(lián)合診斷的AUC顯著高于其單獨診斷的AUC（P<0.05），見圖 1、表 3。

3 討論

PC是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病機制非常復雜，與遺傳因素相關,早期常無癥狀，臨床易出現(xiàn)漏診或誤診，早期診斷率較低[8]。目前，血清tPSA、fPSA是PC患者最主要的診斷篩選方法[9]。PSA是前列腺上皮細胞分泌產(chǎn)生的一種激肽酶家族蛋白，在血清中主要以fPSA、與α1-抗糜蛋白酶結(jié)合形成的復合物（PSA-ACT）以及與α2-巨球蛋白酶結(jié)合形成的復合物三種形式存在,是診斷PC的首選標志物[10]。在生理情況下，PSA在血清中水平極低，一旦前列腺組織受到刺激、損傷或發(fā)生病變,會釋放大量的PSA進入血液中,主要以PSAACT的形式存在于血清中[11,12]。本研究中，PC患者血清tPSA和fPSA水平均顯著升高，f/tPSA顯著下降，且對PC患者均具有一定的診斷價值。王祺等[13]的研究顯示，tPSA、f/tPSA對PC具有較高的診斷價值，但其缺乏腫瘤組織特異性，不足以發(fā)現(xiàn)早期患者，與本研究結(jié)果基本一致，提示tPSA、f/tPSA可用于臨床PC的診斷,但其存在一定的局限性，尋找新的PC血清腫瘤標志物，進行聯(lián)合檢測對提高PC患者的早期診斷率具有重要意義。

圖1 miR-27a、miR-29b、PSA在PC中的診斷價值

表3 miR-27a、miR-29b、PSA在PC中的診斷ROC特征

miRNAs是一類非編碼RNA，可以同時調(diào)控多種基因以及多條信號通路,在多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。本研究檢測了miR-27a、miR-29b在PC患者外周血中的表達,發(fā)現(xiàn)miR-27a的表達量顯著升高，miR-29b的表達量顯著下降，且均對PC具有一定的診斷價值。miR-27a是近年來發(fā)現(xiàn)的癌癥相關的miRNA,可通過負調(diào)控多種靶向基因發(fā)揮其生物學功能，參與乳腺癌、胰腺癌、PC等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展[14,15]。Wan等[16]的研究表明，miR-27a可以作用于雄性激素和PC之間，參與PC的集群調(diào)控反饋機制，促進PC細胞的快速增殖，有望作為PC早期診斷和治療的分子標識物,與本研究結(jié)果基本一致，提示miR-27a在PC患者外周血中的異常高表達可作為其診斷標識物。miR-29b為一種抑癌基因，在多種腫瘤組織中均表達量下降，可以參與機體的多條信號通路，調(diào)控腫瘤細胞的生物學行為[17]。Zhu等[18]的研究顯示，miR-29b可以抑制多種癌基因的表達，抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移，在PC的診斷中具有重要意義,與本研究結(jié)果基本一致，提示miR-29b在PC患者外周血中表達量降低可能與PC細胞的惡性生物學行為有關，其表達量下降對PC具有一定的診斷價值，有望作為其治療的新靶點。本研究聯(lián)合miR-27a、miR-29b以及PSA診斷,發(fā)現(xiàn)其聯(lián)合診斷的AUC顯著高于其單獨診斷的AUC，提示聯(lián)合診斷可以顯著提高PC患者的診斷率，臨床在條件允許的情況下，可以采用聯(lián)合診斷的方法，一期提高其診斷率。

綜上所述，PC患者血清tPSA、fPSA和miR-27a水平均顯著升高，f/tPSA和miR-29b顯著下降，且其均對PC具有一定的診斷價值，miR-27a、miR-29b聯(lián)合PSA診斷可以顯著提高其診斷價值，有望作為其診斷和治療的標識物。但miR-27a、miR-29b作用于PC的具體機制目前尚不清楚，有待于進一步研究。本研究不足之處在于樣本數(shù)量較少，可能會對結(jié)果造成一定的統(tǒng)計學誤差，但本研究仍為PC的診斷和治療提供了新的理論依據(jù)。