趙森銘

(洛陽市食品藥品檢驗(yàn)所,河南 洛陽 471008)

最早固相表面熒光分析技術(shù)是在三硝基甲苯的定量分析中得到應(yīng)用，隨著研究的逐漸深入，這一方法逐漸在其他領(lǐng)域比如生物大分子、氣體檢測(cè)、有機(jī)污染物分析、藥物分析、無機(jī)離子分析等得到廣泛應(yīng)用[1]。因?yàn)槭侵苯佑诠腆w基質(zhì)表面開展固相表面熒光的分析檢測(cè),所以利用固相載體就能夠直接聯(lián)合其他分離技術(shù),因此能夠完成富集目標(biāo)組分、復(fù)雜樣品基體的分離，這樣可以使測(cè)定獲得更高的靈敏度，確保能夠?qū)崿F(xiàn)分析檢測(cè)痕量、微量組分[2]。近些年研究逐漸發(fā)現(xiàn)固相表面熒光分析法能夠提供痕量藥物及其殘留檢測(cè)的定量信息，其具體可以應(yīng)用的檢測(cè)方法包括流動(dòng)系統(tǒng)基礎(chǔ)上的在線固相表面熒光分析、直接固相表面熒光分析法、聯(lián)合應(yīng)用固相萃取分離富集與固相表面熒光分析，本文具體進(jìn)行分析。

1 在線固相表面熒光分析法

1.1 流動(dòng)注射－固相表面熒光法 研究選擇KCL溶液當(dāng)作載流以及固相基質(zhì)材料的再生試劑,完成了單一流路流動(dòng)注射－固相表面熒光奎尼丁、奎寧分析法的建立。控制進(jìn)樣為40μl，能夠準(zhǔn)確定量分析10～650μg/L 的奎寧,進(jìn)樣頻率為 33/h,10～500 μg/L的奎尼丁,進(jìn)樣頻率為40/h[3]。

如果是非熒光性藥物分子,通過熒光衍生法對(duì)固相表面熒光實(shí)施分析檢測(cè)，通常情況下，流動(dòng)注射進(jìn)樣分析更有利于在線衍生操作的順利開展。于流動(dòng)注射－固相表面熒光分析系統(tǒng)中引入進(jìn)光反應(yīng)器，通過紫外光對(duì)維生素B1實(shí)施照射，促使其在線完成向具備強(qiáng)熒光性的光化學(xué)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化,得到的產(chǎn)物可以在流通池內(nèi)填充的C18硅膠上吸附保留,所以能夠完成固相表面熒光檢測(cè)維生素B1[4]。根據(jù)其完成的分析方法對(duì)目標(biāo)分析物的選擇性非常強(qiáng)，能夠在共同具備其他維生素B復(fù)合物的基礎(chǔ)上快速測(cè)定維生素B1。

1.2 聯(lián)合應(yīng)用固相表面熒光法 聯(lián)合應(yīng)用固相表面熒光法可更新表面技術(shù),假設(shè)將固相表面熒光檢測(cè)、流動(dòng)注射方法聯(lián)合起來使用，或者將固相表面熒光檢測(cè)法、順序注射方法聯(lián)合起來使用,這樣即便流通池中填充的固相基質(zhì)可以進(jìn)行循環(huán)再利用,但實(shí)際上大多數(shù)情況下進(jìn)行很多次次吸附操作后，或者多次洗脫操作后，固相基質(zhì)表面會(huì)出現(xiàn)污染表現(xiàn),甚至?xí)霈F(xiàn)有效功能團(tuán)以及活性位點(diǎn)損失的情況,因而會(huì)使得載體表面吸附性能出現(xiàn)變化，洗脫性能也會(huì)出現(xiàn)變化,分析性能會(huì)由此下降[5]。而通過更新表面技術(shù),這一問題得到了有效解決,這一技術(shù)是在每次分析結(jié)束后在廢液中排入使用過的固相基質(zhì)材料,下一次進(jìn)行分析時(shí),反應(yīng)器填充新的固相基質(zhì)材料,這樣僅僅需要更新固相基質(zhì)填充材料就能夠保證較高可靠性，確保檢測(cè)的精密度以及準(zhǔn)確度[6]。

1.3 順序注射－固相表面熒光法 蠕動(dòng)泵可以選擇注射泵代替，完成液流輸送，同時(shí)因?yàn)橐毫麟p向驅(qū)動(dòng)模式能夠程序化控制，所以設(shè)計(jì)流路更為簡(jiǎn)單，也能更加靈活。在具體應(yīng)用中，建議在不同模式的液流操控中選擇某一個(gè)固定的流路裝置,這樣能夠同時(shí)檢測(cè)不同組分。僅僅需要在適當(dāng)時(shí)候?qū)⒕_控制的樣品區(qū)帶、試劑引入后進(jìn)行測(cè)定和分析，連續(xù)載流無需試劑的使用。因而該法針對(duì)長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)檢測(cè)更為適用,同時(shí)能夠顯著降低樣品消耗量以及試劑消耗量[7]。固相表面熒光檢測(cè)的基質(zhì)材料選擇C18鍵合硅膠,固相表面化學(xué)發(fā)光檢測(cè)載體選擇Sephadex QAE A-25樹脂，在不同檢測(cè)流通池中相應(yīng)導(dǎo)入維生素B2、B6、C的樣品溶液,能夠完成分離不同種維生素組分,固相熒光/化學(xué)發(fā)光組在線合檢測(cè),三者的檢出限相應(yīng)是0.12mg/L、0.008mg/L、9.10mg/L。

表1 藥物分析中在線固相表面熒光分析法的分析性能

2 直接固相表面熒光法

這一方法具體是在固體基質(zhì)上點(diǎn)加藥物樣品溶液，等到其完全干燥之后，直接于熒光儀上對(duì)固相基質(zhì)表面殘留的目標(biāo)組分的熒光光譜給予測(cè)定，實(shí)施定性、定量分析[8]。固相表面熒光的基質(zhì)材料有多種選擇，包括聚氯乙烯顆粒、硅膠、纖維素、氧化鋁、濾紙等[9]。這一方法最大的特點(diǎn)在于需要用到的樣品量少，操作難度小，能夠明顯減少分析所需花費(fèi),對(duì)于快速篩查或檢測(cè)大批量樣品非常適用。研究顯示，處于醋酸鈉、C18硅膠、硅膠、纖維素表面時(shí)，卡巴咪嗪不會(huì)有熒光表現(xiàn)，如果處于尼龍膜表面，則會(huì)有強(qiáng)熒光發(fā)射，主要是由于其具備一樣的胺基基團(tuán)[10]。根據(jù)這一表現(xiàn)進(jìn)行固相表面熒光分析法的建立能夠分析測(cè)定藥物制劑中、血清樣品中微量卡巴咪嗪，僅需要消耗7μl樣品量。

3 聯(lián)用固相萃取分離富集、固相表面熒光法

以往固相萃取具體是洗脫后進(jìn)一步開展定性或定量分析,但是其容易出現(xiàn)固相基質(zhì)表面目標(biāo)藥物無法完全洗脫的問題，影響結(jié)果準(zhǔn)確性，另外引入大量洗脫劑會(huì)降解藥物組分,同時(shí)洗脫劑導(dǎo)致的溶劑效應(yīng)會(huì)改變藥物分子結(jié)構(gòu),影響結(jié)果準(zhǔn)確性[11]。而選擇聯(lián)合應(yīng)用固相萃取與固相表面熒光檢測(cè)能夠防止防止溶劑引入洗脫目標(biāo)組分,能夠直接熒光檢測(cè)聚集在吸附劑表面的藥物組分,因此有助于樣品損失量降低，防止出現(xiàn)溶劑效應(yīng)，并且有助于結(jié)果準(zhǔn)確性的提升[12]。

考慮到溶液環(huán)境中熒光強(qiáng)度較弱,針對(duì)部分弱熒光性藥物分子,不可以在常規(guī)熒光方法下進(jìn)行檢測(cè)。選擇固相表面熒光技術(shù)、固相萃取分離富集兩種方法聯(lián)合應(yīng)用能夠解決這一問題，固相萃?。滔啾砻鏌晒夥?、溶液熒光法能夠同時(shí)檢測(cè)強(qiáng)熒光性速尿靈、弱熒光性阿米絡(luò)利。選擇尼龍膜當(dāng)作操作中的固相基質(zhì)材料，尼龍膜能夠富集阿米絡(luò)利，濾液中速尿靈保留下來,尼龍膜上吸附存在的阿米絡(luò)利分子剛性、熒光發(fā)射強(qiáng)度明顯增加，通過固相表面熒光法能夠?qū)嵤┲苯拥臋z測(cè)，相比之下，溶液中相同濃度的阿米絡(luò)利幾乎沒有熒光發(fā)射峰,見圖1、圖2。根據(jù)這一結(jié)果建立起來的分析法對(duì)阿米絡(luò)利的富集倍率為1500倍,檢出限在0.1 μg/L以下,對(duì)于分析測(cè)定痕量阿米絡(luò)利非常適用。

圖1 尼龍膜上阿米絡(luò)利（0.8mg/L）激發(fā)a和發(fā)射b光譜，尼龍膜的熒光發(fā)射背景c，阿米絡(luò)利溶液（0.8mg/l）的激發(fā)d和發(fā)射e光譜

針對(duì)不同藥物分子之間、藥物分子與基體之間存在的熒光廣譜重疊問題,借助固相萃取的選擇性分離這一機(jī)制也能夠有效解決。通過熒光法對(duì)血清中吡羅昔康進(jìn)行測(cè)定,血清基體的熒光發(fā)射對(duì)吡羅昔康的熒光光譜形成影響,且影響較大[13]。通過C18固相萃取膜借助C18鍵以及硅膠的疏水性能夠使吡羅昔康樣品溶液選擇性保留非極性吡羅昔康，同時(shí)能夠分離于基質(zhì)，進(jìn)而能夠通過固相表面熒光法對(duì)C18表面保留的吡羅昔康進(jìn)行檢測(cè)。

圖2 固相表面熒光檢測(cè)系統(tǒng)固體支架示意圖

4 討論

采用固相表面熒光法進(jìn)行藥物分析,能直接測(cè)定固體樣品,具有廣闊的應(yīng)用前景,建議推廣使用。要想順利實(shí)施固相表面熒光分析,或者選擇兩種技術(shù)進(jìn)行聯(lián)合分析,必須確定適合的固相基質(zhì)材料，尼龍膜、葡聚糖凝膠、硅膠等一直是當(dāng)前應(yīng)用比較廣泛的基質(zhì)材料,但是其僅能夠用于對(duì)有限的藥物組分進(jìn)行分析[14]。所以在往后的研究中，應(yīng)該注重研究開發(fā)更多新型的材料,這些材料不僅應(yīng)該有較高的合成光學(xué)透明度,還應(yīng)該能夠選擇性吸附藥物。通過化學(xué)改進(jìn)、表面修飾等技術(shù)的應(yīng)用，促使基質(zhì)材料吸附選擇性逐漸提升,將其熒光背景減弱,因而藥物分析中固相表面熒光應(yīng)用范圍會(huì)得以提升。

固相填充材料選擇合理除了能夠富集部分特定目標(biāo)組分，還能夠分離與檢測(cè)多元目標(biāo)組分，特別針對(duì)簡(jiǎn)單二元混合物體系，無需色譜分離，通過簡(jiǎn)單的固相表面熒光檢測(cè)裝置就可以分離、檢測(cè)以及富集。對(duì)于現(xiàn)代藥物分析工作，樣品基體的要求逐漸復(fù)雜多樣,所以固相表面熒光分析法也應(yīng)該注重結(jié)合其他分析技術(shù)包括增敏、衍生、分離以及富集,形成具備靈活性以及多樣性的在線分析模式,能夠快速檢測(cè)復(fù)雜基體樣品中存在的不同種藥物組分，使其可以一起完成測(cè)定。