胡甲元，陸浩天,翟佳莉，葛靜如，解永巖

（1.合肥樂凱科技產業(yè)有限公司，安徽 合肥230041；2.安徽醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，安徽 合肥230032；3.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥230012）

卡托普利（Captopril）結構式如圖1A，它是一種口服可吸收且能有效控制血壓的血管緊張素轉化酶抑制劑[1]，已經成為醫(yī)治高血壓[2]、心力衰竭[3]、慢性心功能不全[4-5]等心血管疾病的重要藥物，但長期或過量使用可能導致經常性干咳、蛋白尿，甚至膽汁淤積等副作用[6-9]，因此對血液系統(tǒng)（如血清、血漿甚至全血）中卡托普利的定量分析非常重要。目前已報道的卡托普利的分析方法如毛細管電泳法[10]、高效液相色譜法[11-12]、化學發(fā)光法[13]等存在儀器設備昂貴、操作復雜耗時、分析時間長、需要對樣品進行衍生等不足。電化學方法具有儀器設備簡單、響應迅速、選擇性和靈敏度可控等優(yōu)勢[14]，因此建立簡單快速的卡托普利的電化學分析方法對于指導其臨床安全用藥，了解其臨床上的藥效關系等是十分必要的。

8-羥基-1,3,6-三磺酸芘（8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt,HPTS）（圖1B）是一種有機光酸，具有較快的電極過程動力學以及可逆的電化學氧化還原行為，但目前還沒有使用HPTS 作為電化學催化劑或者氧化還原電子媒介體對分析物進行電化學分析的報道。

本研究首次采用HPTS 作為卡托普利的電化學氧化的催化劑，建立了一種簡單有效的卡托普利的電化學分析方法。本方法具有操作簡單、檢測速度快等優(yōu)點，并成功應用于血漿樣品中卡托普利的分析檢測。

1 實驗部分

1.1 藥品與試劑

圖1 卡托普利（A）和HPTS（B）的化學結構式

卡托普利，阿拉丁化學試劑有限公司；8-羥基-1,3,6-三酸芘（HPTS），阿法埃莎（中國）化學有限公司；Britton-Robinson buffer（B-R buffer）緩沖液由40 mM 磷酸、40 mM 醋酸和40 mM 硼酸組成，用0.2 M NaOH調至不同pH；0.1 M 磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate-buffered solution，PBS）用磷酸配制調至pH為7.4；實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

CHI730E 電化學工作站（上海辰華有限公司）；EX125DZH 十萬分之一天平（奧豪斯儀器有限公司，常州）；PHS-3C型pH計（世紀方舟科技有限公司，成都）；超聲清洗儀；79-1 磁力攪拌器（國宇儀器制造有限公司，常州）。

1.3 電化學測試

實驗采用三電極體系，拋光過后的裸玻碳電極作為工作電極，Ag/AgCl（內參為飽和氯化鉀）作為參比電極，鉑絲作為對電極。玻碳電極（Φ=3 mm）作為工作電極。使用前首先分別經粒徑為3.0 μm、1.0 μm、0.05 μm的Al2O3粉末拋光，然后再置于無水乙醇和水中各超聲清洗3 min，N2吹干備用。實驗中采用循環(huán)伏安（CV）技術和線性掃描（LSV）技術，所有實驗均在室溫下進行。比較不同pH 條件下HPTS 對卡托普利的電化學催化性能時，為避免不同pH 條件下相同濃度HPTS 自身的氧化電流的不同，數(shù)據(jù)處理采用歸一化處理，即用催化電流比值（ΔI/I）來衡量不同pH 條件下的催化效果。其中ΔI/I=IHPTS+captopril-IHPTS/IHPTS。

1.4 動物手術實驗動物

雄性Sprague-Dawley 大鼠3 只（200～250 g），購自安徽醫(yī)科大學動物實驗中心。動物分養(yǎng)于室溫和自然光照周期環(huán)境中，并自由飲水和取食。實驗符合安徽中醫(yī)藥大學生物醫(yī)學倫理委員會的“實驗動物的護理和使用指南”。用3%戊巴比妥鈉（1.3 mL/kg）腹腔注射麻醉，從大鼠腹主動脈收集血漿，轉移到含有肝素抗凝劑的離心管中，3 000 r/min進行離心，離心15 min，取上清液得到血漿。實驗結束后，立即麻醉后斷頭處死大鼠，動物尸體由安徽中醫(yī)藥大學動物房回收。

1.5 實際樣品測試

配制500 μM的HPTS 2 mL(pH為7.4)于燒杯中，分別加入40 μL 的空白血漿（稀釋50 倍）和10 μL 2 mM、10 μL 10 mM、10 μL 100 mM 的卡托普利溶液進行實際樣品測試，重復三次。采用線性掃描技術（LSV）測定樣品溶液，掃描電位0.32～0.68 V，掃速為50 mVs-1。

2 結果與討論

2.1 基于HPTS卡托普利的電化學催化氧化行為研究

圖2 500 μM 卡托普利（黑線）、500 μM HPTS（紅線）和500 μM 卡托普利500 μM HPTS混合物（藍線）在玻碳電極上的循環(huán)伏安圖（掃描速度：50 mV×s-1）

卡托普利的巰基氧化為二硫鍵的電化學氧化，具有較大的過電位以及較慢的電極動力學過程，如圖2中黑線所示，單獨的卡托普利在玻碳電極上從+0.6 V（vs.Ag/AgCl）開始緩慢氧化。HPTS 在pH 7.4 條件下，E1/2為+0.51 V處出現(xiàn)一對可逆的氧化還原峰，對應于HPTS的酚羥基和HPTS 醌自由基的一電子過程[15]。當往HPTS 溶液中加入卡托普利后，可以看到相較于相同濃度單獨的HPTS，二者混合物的氧化電流顯著增加（圖2，藍線），表明HPTS 對卡托普利的電化學氧化具有明顯的催化行為，這為利用HPTS 作為電化學催化劑來建立卡托普利的電化學分析方法提供了先決條件。

2.2 實驗條件優(yōu)化

2.2.1 卡托普利的電化學催化氧化對pH的依賴性考查

以上結果表明，HPTS 可以作為卡托普利電化學氧化有效的電化學催化劑，可以據(jù)此建立基于HPTS 的卡托普利的電化學分析方法。由于HPTS 的電化學氧化過程是pH依賴的，因此，我們用CV技術考查了不同pH條件下，HPTS對卡托普利的電化學氧化的催化性能，如圖3 所示，溶液pH 從5.0 增大到7.4，HPTS 的E1/2不斷負移，隨后不再移動。HPTS 氧化電流增加比率(ΔI/I)，隨著pH 增大不斷增加，在pH 為7.4 時，(ΔI/I)達到最大值，而后隨著pH 的增大ΔI/I 降低，表明HPTS 在生理條件下（pH 為7.4）對卡托普利的電化學氧化具有最大的催化效果，因此本研究選擇pH為7.4作為卡托普利的電化學分析的最優(yōu)化pH。

2.2.2 卡托普利的電化學催化氧化對HPTS 濃度依賴性的考查

圖3 單獨的500 μM HPTS（虛線）、500 μM 卡托普利和500 μM HPTS混合物（實線）在不同p H條件下的循環(huán)伏安曲線（掃描速度：50 mV×s-1，插入圖：催化電流比率（ΔI/I）和溶液pH的關系曲線）

電化學催化劑的濃度大小會直接影響到分析方法的分析性能。我們考查了在最優(yōu)化pH為7.4下，濃度為200 μM、500 μM、1 mM、2 mM 的HPTS 對不同濃度的卡托普利的電化學催化氧化的影響，結果如圖4 所示。在200 μM HPTS 的條件下，卡托普利的電流響應不成線性，這可能是由于較低濃度的HPTS 對卡托普利的電化學催化效果不明顯所致。500 mM 的HPTS 的催化電流響應在1～1 000 μM卡托普利的濃度范圍成良好的線性關系（I（μA）=0.002 7 C（μM）+1.35，相關系數(shù)為0.99）。隨著HPTS濃度的增加，靈敏度逐漸降低?；? mM HPTS和2 mM HPTS的卡托普利的分析方法靈敏度分別為0.002 5 mA/mM和0.002 3 mA/mM。較高濃度的HTPS 導致方法靈敏度下降，主要是由于高濃度的HPTS 具有較大的氧化背景電流。因此本研究選擇500 μM HPTS作為分析卡托普利的最佳實驗條件。

2.3 線性考查

圖4 在p H 為7.4條件下，200 μM、500 μM，1 mM、2 mM 的HPTS分別對1 μM、2 μM、5 μM、10 μM、20 μM、50 μM、100 μM、200 μM、500 μM、800 μM和1 000 μM的卡托普利的電化學氧化的峰電流與其相應的濃度之間的線性關系

鑒于上述方法對卡托普利良好的電催化性能，在最優(yōu)的實驗條件下，用線性掃描技術（LSV）對卡托普利電化學分析進行了方法學考查，如圖5所示。在1～1 000 μM的濃度范圍，氧化電流與卡托普利濃度呈現(xiàn)出良好的線性關系，其線性回歸方程為I（μA）=0.002 7 C（μM）+1.35，相關系數(shù)為0.99，根據(jù)3 σ，計算檢測限為0.42 μM。

2.4 實際樣品測定

為了評估本方法對實際樣品中卡托普利定量分析的有效性，我們用稀釋了50 倍的大鼠血漿對本方法進行了驗證，結果如圖6 所示。結果表明，在最優(yōu)化實驗條件下，空白血漿在本研究建立的基于HPTS 的電化學分析體系中的氧化峰電流響應（紅線）與緩沖溶液中獲得的氧化峰電流(藍線)相同，這表明基于HPTS 的卡托普利的電化學方法具有較好的選擇性，方法不受血漿中內源性物質電活性物種的干擾。為了進一步驗證該方法用于實際血漿中卡托普利定量分析的可行性，對血漿樣品進行了加標回收試驗。相較于緩沖溶液（藍線）和空白血漿溶液（紅線），加入了10 μM、50 μM 和500 μM卡托普利的血漿，氧化峰電流明顯增加。其加標回收實驗結果見表1，加標回收率為98.3%，相對標準偏差為2.2%。結果表明，該方法具有較高的準確度和精確度，可以用作卡托普利藥物相關的常規(guī)檢測及臨床分析。

圖5 濃度為1～1 000 μM的卡托普利和500 μM HPTS混合溶液的線性掃描伏安圖（插入圖：500 μM HPTS對1～1 000 μM的卡托普利的電化學氧化峰電流與卡托普利濃度之間的線性關系）

圖6 含500 μM HPTS的0.1 M PBS(7.4)溶液（藍線）、含有50 μM被稀釋空白血漿和500 μM HPTS的0.1 M PBS(7.4)溶液（紅線）以及在紅線溶液中加入10 mM、50 mM、500 mM卡托普利的線性掃描伏安圖

3 結論

表1 空白血漿的加標回收試驗

本研究首次利用HPTS 作為卡托普利電化學氧化的電化學催化劑，建立了一種簡單快速、靈敏可靠、選擇性好的卡托普利電化學分析方法。結果表明，該方法具有操作簡單、響應時間快、選擇性好的特點和優(yōu)勢，可有效用于實際血樣中卡托普利的定量分析。本研究為卡托普利的臨床安全用藥以及理解其藥效關系提供了有效的手段和方法。