雷哲 ，高改云 ，倪猛 ，楊旭

（南陽(yáng)市中心醫(yī)院，1.消化一科，2.檢驗(yàn)科，河南 南陽(yáng) 473400）

臨床上胃癌的發(fā)生率具有一定的上升表現(xiàn)，流行病學(xué)研究證實(shí)，我國(guó)2010-2017年部分地區(qū)胃癌的平均發(fā)病率可達(dá)283~483/10萬人左右[1]。臨床上胃癌患者的五年生存率及無瘤生存時(shí)間等指標(biāo)均較差，中位生存時(shí)間不足48個(gè)月[2]。

在揭示胃癌等消化系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制的過程中發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關(guān)蛋白的表達(dá)異常能夠顯著影響癌細(xì)胞的生物學(xué)特征,影響腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過程。乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制基因1（BRMS1）是重要的細(xì)胞轉(zhuǎn)移調(diào)控因子,其能夠通過降低癌細(xì)胞的變形能力，減輕癌細(xì)胞對(duì)于基底膜組織的浸潤(rùn)過程，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,抑制惡性腫瘤的病情進(jìn)展[3]。部分研究者報(bào)道了BRMS1蛋白的表達(dá)在乳腺癌或者甲狀腺癌等惡性腫瘤患者病灶組織中的表達(dá)情況，認(rèn)為BRMS1蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率的下降能夠顯著促進(jìn)乳腺癌惡性腫瘤的臨床分期的進(jìn)展，導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的上升[4,5]，在胃癌中的分析研究不足。為了揭示BRMS1蛋白的表達(dá)與胃癌病理學(xué)特征的關(guān)系,從而為臨床上胃癌的診療提供理論基礎(chǔ),本次研究選取我院2015年01月-2017年01月收集的90例胃癌粘膜組織,探討了BRMS1蛋白的表達(dá)及其與患者臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取我院2015年01月-2017年01月收集的90例胃癌粘膜組織 （胃癌組）、45例符合標(biāo)準(zhǔn)的胃癌癌旁組織（癌旁組）。

胃癌組，年齡42~78歲，平均為59.5±11.0歲，男55例、女35例，TNM分期：Ⅰ期20例、Ⅱ期34例、Ⅲ期30例、Ⅳ期6例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例；組織分化：高分化18例、中分化40例、低分化32例。癌旁組，年齡45~73歲，平均為57.8±10.0歲，男25例、女20例。兩組研究對(duì)象的年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴胃癌的診斷以病理學(xué)檢查結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)；⑵胃癌患者獲取癌組織標(biāo)本前未進(jìn)行放化療、免疫治療；⑶研究對(duì)象的基礎(chǔ)資料完整；⑷本研究獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴未經(jīng)病理學(xué)證實(shí)；⑵轉(zhuǎn)移性胃癌；⑶既往伴有風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病。

1.2 免疫組化檢測(cè)方法 所有組織標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋后作連續(xù)切片，厚度約為4μm，采用免疫組化鏈霉卵白素一生物素復(fù)合體法 (strep avidin—biotin complex，SABC 法)染色，二氨基聯(lián)苯胺(diamionben zidene，DAB)顯色。BRMS1蛋白通用型二抗以及SP試劑盒和DAB顯色盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)公司。以陽(yáng)性片及PBS代替一抗分別作為陽(yáng)性及陰性對(duì)照，高倍顯微鏡下觀察BRMS1蛋白的表達(dá)情況，具體染色步驟嚴(yán)格按照SP試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 免疫組化判斷標(biāo)準(zhǔn) 免疫組化結(jié)果判定：BRMS1蛋白陽(yáng)性著色定位于細(xì)胞核及細(xì)胞漿，陽(yáng)性著色呈黃色、棕黃色、褐色表達(dá)，⑴根據(jù)著色強(qiáng)度：0分為無色、1分為淡黃色、2分為棕黃色、3分為褐色、黑色；⑵根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目所占比例≤10%為1分、陽(yáng)性細(xì)胞所占比例11%～50%為2分、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)51%～75%為3分、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占比例>75%為4分，兩種積分相乘總分<3分為陰性、≧3分為陽(yáng)性。

1.4 Western-blot檢驗(yàn)方法 將所研磨的蛋白與上樣緩沖液以5：1的濃度相互混合，80~100℃煮沸5 m in。根據(jù)不同的蛋白分子量水平，配制并灌注相應(yīng)的12%的分離膠和5%的濃縮膠,按15 g／孔蛋白量進(jìn)行組織蛋白的上樣，進(jìn)行SDS．PA GE電泳，電泳后根據(jù)條帶進(jìn)行切膠,半濕法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，BSA蛋白封閉2h，加入含10%BSA一抗及二抗（1：1000），磷酸鹽緩沖液清洗 3 次，每次 5min，進(jìn)行曝光及膠片弧度的讀取。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)表述采用（x±s）表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用兩組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS16.0版本。

2 結(jié)果

2.1 兩組標(biāo)本中的BRMS1蛋白陽(yáng)性率、Westernblot檢測(cè)結(jié)果比較 胃癌組的BRMS1蛋白陽(yáng)性率38.89%低于癌旁組的80.00%，P<0.05，見表1。

表1 兩組標(biāo)本中的BRMS1蛋白陽(yáng)性率[n（%）]

胃癌組的BRMS1蛋白相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度顯著的低于癌旁組，P<0.05，見表2。

表2 兩組標(biāo)本中的BRMS1蛋白Western-blot檢測(cè)結(jié)果比較（x±s，/βaction）

2.2 胃癌組織中的BRMS1蛋白表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 TNM分期（Ⅰ期+Ⅱ期）、未及漿膜、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組的BRMS1蛋白陽(yáng)性率顯著的高于TNM分期（Ⅲ期+Ⅳ期）、及漿膜、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者，P<0.05；BRMS1蛋白陽(yáng)性率在不同年齡、性別、分化程度、病灶直徑的胃癌組織中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。見表3。

表3 胃癌組織中的BRMS1蛋白表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

3 討論

合并有病毒感染特別是幽門螺桿菌病毒感染的人群中,胃黏膜上皮細(xì)胞的病變風(fēng)險(xiǎn)可顯著的上升[6]。長(zhǎng)期的外在的病理性刺激因素及內(nèi)在的遺傳易感基因的攜帶等,均能夠?qū)е挛赴┌l(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的上升。治療隨訪研究顯示,現(xiàn)階段臨床上胃癌手術(shù)治療后的病情緩解率較低,同時(shí)綜合性措施治療后的患者5年內(nèi)的病死率并無顯著的下降[7,8]。而免疫靶向治療能夠在輔助治療胃癌的過程中發(fā)揮一定的作用,本研究對(duì)于胃癌病灶組織中的腫瘤相關(guān)蛋白的分析,能夠?yàn)榕R床上胃癌患者的免疫靶向治療提供理論作用靶點(diǎn),并能夠?yàn)槲赴┗颊叩呐R床病情評(píng)估提供免疫組化分析指標(biāo)。

BRMS1是細(xì)胞凋亡或者轉(zhuǎn)移調(diào)控因子,其能夠通過抑制癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換過程的形成，抑制癌細(xì)胞對(duì)于基底膜的突破作用,進(jìn)而降低癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)近年來相關(guān)基礎(chǔ)方面的研究還認(rèn)為，BRMS1不僅能夠影響癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程，同時(shí)還能夠通過對(duì)于腫瘤信號(hào)通路的激活,交錯(cuò)式激活患者體內(nèi)的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,抑制癌細(xì)胞DNA的擴(kuò)增速度。BRMS1蛋白通過對(duì)于絡(luò)氨酸的磷酸化修飾過程,抑制癌細(xì)胞膜表面糖蛋白配體的過度激活,穩(wěn)定癌細(xì)胞周期調(diào)控依賴性蛋白激活的轉(zhuǎn)錄及翻譯，降低G1/S期比例，提高G0期細(xì)胞的總數(shù)[9]。部分研究者探討了BRMS1蛋白在乳腺癌患者組織中的表達(dá)情況，認(rèn)為BRMS1能夠顯著抑制癌細(xì)胞的肺部或者腦部轉(zhuǎn)移過程,并能夠降低鎖骨下淋巴結(jié)及胸骨旁淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn),但在胃癌病灶組織中的研究不足。

在本研究中可以發(fā)現(xiàn)胃癌病灶組中的BRMS1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率38.89%及表達(dá)濃度均明顯的下降,低于癌旁組織80%,差異較為明顯,提示了BR MS1的異常表達(dá)可能參與到了胃癌的病情進(jìn)展過程中，通過匯集不同的相關(guān)文獻(xiàn)，筆者認(rèn)為這主要考慮與BRMS1的下列生理病理作用有關(guān)[10-12]：⑴BRMS1的表達(dá)下降可提高癌細(xì)胞的變形能力，使癌細(xì)胞對(duì)于臨近正常組織的浸潤(rùn)和粘附能力明顯的上升；⑵BRMS1的表達(dá)下降還能夠影響癌細(xì)胞的周期,導(dǎo)致癌細(xì)胞跨越G0期的速度明顯的增快。袁圓等[13]研究者也探討了BRMS1的表達(dá)與胃癌的病情關(guān)系,認(rèn)為在胃癌病灶組織中BRMS1蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率可平均下降35%以上,同時(shí)患者的高腫瘤負(fù)荷越高,體內(nèi)的腫瘤病灶擴(kuò)散速度越快，BRMS1蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率越低。在探討B(tài)RMS1蛋白的表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系過程中，可以發(fā)現(xiàn)在臨床分期較晚、發(fā)生了漿膜浸潤(rùn)或者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者中，BRMS1蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率顯著的下降，提示了BRMS1的表達(dá)下降能夠顯著促進(jìn)胃癌患者臨床病理特征的進(jìn)展，這主要考慮與BRMS1蛋白的表達(dá)下降能夠影響到癌細(xì)胞對(duì)于臨近正常組織的粘附能力,導(dǎo)致癌細(xì)胞對(duì)于淋巴結(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的浸潤(rùn)過程的增強(qiáng)，并提高了癌細(xì)胞對(duì)于胃黏膜下肌層的浸潤(rùn)深度等有關(guān)[14,15]。本研究中并未發(fā)現(xiàn)BRMS1蛋白的表達(dá)與胃癌患者癌細(xì)胞分化程度的關(guān)系，提示BRMS1的表達(dá)并不能影響到癌細(xì)胞的分化誘導(dǎo)成熟過程。但部分研究者認(rèn)為BRMS1蛋白的表達(dá)下降與癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或者臨床分期有關(guān),而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并無明顯的關(guān)系[11]，這與本研究的結(jié)論存在一定的差距,考慮可能與胃癌患者的基礎(chǔ)性病情的差別較大、BRMS1蛋白檢測(cè)靈敏度差異等有關(guān)。

綜上所述，胃癌組織中BRMS1蛋白表達(dá)下調(diào),并且與腫瘤浸潤(rùn)深度及是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有一定的相關(guān)性。