劉聰，張麗琴，徐靜，劉婷，林燕

(贛州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科分子實(shí)驗(yàn)室，江西 贛州 341000)

我國人口基數(shù)大,新生兒出生缺陷頻率也相對較高，這跟我國飲食習(xí)慣有直接關(guān)系。大量研究表明,葉酸攝入不足或不能被人體有效利用是導(dǎo)致出生缺陷的主要原因[1]。2017年《圍受孕期增補(bǔ)葉酸預(yù)防神經(jīng)管缺陷指南》中指出，孕前3個月到孕后12周每天服用葉酸量不低于400mg來降低新生兒出生缺陷率。亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因位于1P36.3,有多種基因多態(tài)性,最常見的是C6 77T，是葉酸及HCY（同型半胱氨酸）代謝的關(guān)鍵酶,將5，10-亞甲基四氫葉酸還原為5-亞甲基四氫葉酸。5-亞甲基四氫葉酸作為血清及組織中葉酸主要存在形式,參與體內(nèi)DNA、RNA和蛋白質(zhì)等的甲基化修飾及多種重要的生化反應(yīng)。當(dāng)MTHFR 677位點(diǎn)堿基發(fā)生突變（C>T）時,MTHFR酶活性降低，導(dǎo)致5-亞甲基四氫葉酸減少，影響蛋白質(zhì)等大分子甲基化程度，導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常[2]。有關(guān)研究表明由該基因突變導(dǎo)致新生兒出生缺陷概率約為13.4‰[3],并有逐年上升趨勢。雜合CT基因型MTH FR酶活性為60%左右,而純合TT基因型MTHFR酶活性為30%左右，酶活性減低導(dǎo)致葉酸利用障礙，引起復(fù)發(fā)流產(chǎn)、神經(jīng)管畸形、妊娠期高血壓等疾病[4]。在中國人群中MTHFR基因異常發(fā)生率高達(dá)17%~47%[1]。本文通過檢測贛南地區(qū)MTHFR（C677T)基因突變分布情況，以此了解該地區(qū)該基因多態(tài)性分布。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以2017年5月-2018年3月間，來贛州市人民醫(yī)院就診患者為研究對象,共1787例，平均年齡為（28.36±4.23）歲。入組原則：⑴近期未做過手術(shù)，無肝腎、血液等系統(tǒng)疾病，無精神障礙等疾病，各自間無親緣關(guān)系；⑵本研究由贛州市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn),患者本人簽署知情者同意書。

1.2 儀器和試劑 MTHFR基因檢測試劑盒由深圳奧薩醫(yī)療有限公司生產(chǎn),基因擴(kuò)增儀為羅氏Z480熒光定量PCR儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 采用PCR-熒光探針法,采集患者EDTA抗凝全血2ml，按試劑盒操作步驟進(jìn)行DNA提取,按以下步驟進(jìn)行 PCR，50℃ 2min；95℃ 2min；95℃ 15s；60℃ 1min，45個循環(huán)。 熒光信號收集定在FAM和VIC，60℃時收集數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 對受檢孕婦進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn),對數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析,贛南地區(qū)十八個縣該基因突變頻率進(jìn)行比較，總數(shù)據(jù)分別與山東、河南兩省進(jìn)行比較，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 采用熒光定量PCR法對MTHFR（C677T）基因型及Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn) 陰性對照一般無擴(kuò)增曲線或有微量起峰，CC型為單個VIC通道成S型擴(kuò)增曲線；CT型為VIC和FAM兩個通道成S型擴(kuò)增曲線；正常的信號分為4堆，靠近原點(diǎn)處為NTC；靠近 X軸的是VIC信號(CC基因型)；靠近Y軸的是FAM信號(TT基因型)；靠近對角線位置的樣品既有 FAM信號也有 VIC信號 （CT基因型）,強(qiáng)度為 FAM和 VIC各自的一半左右,如圖1所示。Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測驗(yàn)：P=0.827,P>0.05，說明此標(biāo)本具有群體代表性。

圖1 散點(diǎn)圖

2.2 MTHFR（C677T）基因型與補(bǔ)充葉酸計量的關(guān)系 不同基因型補(bǔ)充葉酸計量有差異，如圖2所示。

2.3 贛南地區(qū)不同縣MTHFR（C677T）基因分布情況 將贛南地區(qū)十八個縣數(shù)據(jù)進(jìn)行比較無差異性，無統(tǒng)計學(xué)意義 （P>0.05）χ2=16.629 P=0.549>0.05，見表1。

圖2 不同MTHFR（C677T）基因型補(bǔ)充葉酸量

表1 贛南地區(qū)十八個縣MTHFRC677T基因型比較

2.4 贛南地區(qū)與山東、河南等地區(qū)MTHFR（C677T）基因型比較 本文將贛南地區(qū)數(shù)據(jù)分別與山東[5]、河南[5]等省份數(shù)據(jù)進(jìn)行比較有差異性，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000<0.01），見表 2。

表2 贛南地區(qū)與山東、湖北、新疆等省MTHFR（C677T）基因型比較

3 討論

葉酸是一種水溶性B組維生素,最初是從菠菜中提取得到。對熱不穩(wěn)定，易在烹飪過程中破壞，而我國的飲食習(xí)慣主要以烹飪?yōu)橹?。因此盡管食物中含有豐富葉酸，實(shí)際能被人體吸收、利用的卻很有限。對于某些特殊人群，如高同型半胱氨酸患者、孕期婦女等,他們對葉酸需求量要比正常人多，甚至要翻倍補(bǔ)充，但由于遺傳因素原因，相當(dāng)一部分人由于MTHFR（C677T）基因位點(diǎn)突變導(dǎo)致葉酸利用轉(zhuǎn)化能力下降,因此這部分人群極易出現(xiàn)葉酸缺乏。葉酸又是是合成核酸所必需的元素，是細(xì)胞生長和組織修復(fù)所必需的物質(zhì),更是胚胎發(fā)育過程中不可缺少的營養(yǎng)素。葉酸的缺乏會導(dǎo)致胎兒發(fā)育異常，如Down綜合癥、唇腭裂、自然流產(chǎn)等[6-7]，也會增加腦卒中風(fēng)險。

人類MTHFR基因是葉酸代謝的關(guān)鍵酶，具有多種基因型，其中最常見的是第677位堿基C被T置換，產(chǎn)生Ala222Val錯義突變，合成的蛋白質(zhì)會出現(xiàn)酶活性改變，純合突變基因型（TT）編碼蛋白的酶活性相當(dāng)于純合野生基因型（CC）的30%，雜合基因型（CT）編碼蛋白的酶活性相當(dāng)于純合野生基因型編碼酶活性的65%。該酶活性的降低會引發(fā)葉酸利用障礙，在孕早期會干擾神經(jīng)管閉合，導(dǎo)致先天性心臟病[8]、神經(jīng)管缺陷[9]等多種出生缺陷疾??；同時會引起高同型半胱氨酸血癥，損傷內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞激活促凝因子，使機(jī)體處于高凝狀態(tài)，從而引發(fā)血栓，增加腦血管疾病[10]風(fēng)險。有研究表明，MTHFRC 677T基因多態(tài)性與前列腺癌[11]、口腔癌[12]、甲狀腺癌[13]、2型糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展[16]等有關(guān)。

MTHFR基因多態(tài)性存在地域差異性[14]，本研究表明贛南地區(qū)與山東、河南等省份比較有差異性，但贛南地區(qū)內(nèi)十八個縣相比較無差異性。本研究通過分析來我院就診的1495例患者M(jìn)THFR（C677T）基因型，將此數(shù)據(jù)與已報道省份比較，發(fā)現(xiàn)MTHFRC677T的等位基因分布頻率與地域有關(guān),突變基因型T的頻率在我國從南往北逐漸升高[15]，這與我國報道的出生缺陷北高南低的事實(shí)相符[16,17]。 因此，通過 MTHFR（C677T）大樣本分子流行病學(xué)調(diào)查，了解其與葉酸利用代謝的關(guān)系，分析其基因頻率分布特點(diǎn)，可以為指導(dǎo)地區(qū)人群補(bǔ)充葉酸提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。