楊苗苗， 鄔志惠， 涂正坤

吉林大學(xué)第一醫(yī)院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院， 長(zhǎng)春 130021

HBV感染是一個(gè)關(guān)乎全世界人類(lèi)健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題。HBV感染肝細(xì)胞后不直接造成肝細(xì)胞損傷，但誘導(dǎo)肝臟內(nèi)固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，從而引起肝臟炎癥和損傷[1]。持續(xù)的HBV感染最終導(dǎo)致各種肝臟疾病，包括肝硬化、肝癌以及肝衰竭[2]。

肝星狀細(xì)胞(HSC)作為肝纖維化形成的主要效應(yīng)細(xì)胞，占所有肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的5%左右[3]。位于肝竇間隙的HSC，與肝細(xì)胞及肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞存在密切關(guān)系。在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的研究[4]中發(fā)現(xiàn)，活化的HSC誘導(dǎo)肝脂肪病變并且促進(jìn)炎性分子的產(chǎn)生。在穩(wěn)定的生理?xiàng)l件下，HSC通過(guò)分泌趨化因子誘導(dǎo)外周單核細(xì)胞向肝臟的募集維持肝臟巨噬細(xì)胞的水平，同時(shí)將單核細(xì)胞印上Kupffer細(xì)胞的記號(hào)，形成肝組織特異性的巨噬細(xì)胞[5]?；颊吒闻K中HSC與自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)的接觸更加頻繁，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示HSC周?chē)腘K細(xì)胞數(shù)量明顯增加。因此，探究HBV作用下HSC與肝內(nèi)細(xì)胞之間的相互作用對(duì)明確HBV引起的肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制具有重要指導(dǎo)作用。

肝臟內(nèi)單核/巨噬細(xì)胞通過(guò)其強(qiáng)大的吞噬能力、細(xì)胞表面高密度的模式識(shí)別受體以及釋放的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)肝臟的天然免疫，抵御病原體的侵害維持肝臟環(huán)境穩(wěn)定。在肝損傷后單核/巨噬細(xì)胞通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)和釋放抗炎細(xì)胞因子緩解炎癥和纖維化。隨著不斷深入的研究發(fā)現(xiàn)單核/巨噬細(xì)胞的極化和功能可以被病原體以及肝內(nèi)細(xì)胞調(diào)節(jié)，其中HSC對(duì)單核/巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)至關(guān)重要[6]。

NK細(xì)胞是機(jī)體抵抗病毒感染和腫瘤的主要天然免疫成分[7]，在抑制肝纖維化方面發(fā)揮著重要作用，主要通過(guò)殺傷活化的HSC發(fā)揮抗纖維化功能[8]。但是對(duì)于病原體及肝內(nèi)細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用研究相對(duì)較少。事實(shí)證明，HBV感染導(dǎo)致肝內(nèi)NK細(xì)胞的功能障礙，活化的HSC可抑制NK細(xì)胞的活力。

本文探討了HBV誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和肝臟炎癥對(duì)肝纖維化的作用。在HBV作用的條件下，強(qiáng)調(diào)HSC、單核/巨細(xì)胞和NK細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，從不同的角度闡述肝內(nèi)非實(shí)質(zhì)細(xì)胞對(duì)HBV相關(guān)的疾病的影響。

1 HBV誘導(dǎo)的肝臟炎癥及其對(duì)肝纖維化的影響

1.1 HBV與肝臟炎癥 HBV感染后引起的異常的免疫應(yīng)答導(dǎo)致肝臟炎癥的形成，但是，對(duì)于HBV感染誘導(dǎo)的肝臟炎癥的確切機(jī)制尚不完全清楚。大量證據(jù)[9]表明，由內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)觸發(fā)的HBV非特異性免疫應(yīng)答是引發(fā)肝臟炎癥的主要原因。HBV感染后導(dǎo)致天然免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)和活化，導(dǎo)致凋亡或壞死肝細(xì)胞中DAMPs的積累，而DAMPs是最有效的炎癥信號(hào)。內(nèi)源性DAMPs被認(rèn)為具有特定的免疫原性，可以作用于單核/巨噬細(xì)胞表面的Toll樣受體(TLR)2和TLR4，促進(jìn)Caspase-1激活釋放IL-1β，也可與樹(shù)突狀細(xì)胞細(xì)胞的TLR9作用募集MyD88，隨后激活NF-κB和AP-1，從而傳遞炎癥信號(hào)。HBV感染后肝臟中NK細(xì)胞的數(shù)量增加了近20倍，主要通過(guò)產(chǎn)生IFNγ發(fā)揮作用，激活NKT細(xì)胞導(dǎo)致快速的肝臟炎癥反應(yīng)。HBV感染后導(dǎo)致中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)并且通過(guò)釋放細(xì)胞毒素和活性氧(ROS)影響肝臟炎癥，肝細(xì)胞的壞死也可引起嚴(yán)重的中性粒細(xì)胞炎癥導(dǎo)致肝損傷加重[10]。

1.2 肝纖維化的啟動(dòng) 關(guān)于肝纖維化發(fā)病機(jī)制的一般理論認(rèn)為，纖維化是由炎癥引起的，慢性炎癥激活HSC分化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，同時(shí)天然免疫系統(tǒng)在調(diào)節(jié)纖維化過(guò)程中也起關(guān)鍵作用，但對(duì)于HBV相關(guān)的肝纖維化機(jī)制尚未完全闡明。HBV引起肝臟炎癥后，大量的炎性因子刺激免疫細(xì)胞表達(dá)血小板生長(zhǎng)因子、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子，TGFβ以及IL-13，誘導(dǎo)HSC活化[11]。研究[12]顯示，肝損傷后肝細(xì)胞通過(guò)釋放可溶性細(xì)胞因子啟動(dòng)HSC的活化，而壞死的肝細(xì)胞釋放的DAMPs引發(fā)的炎癥通過(guò)直接或間接的方式啟動(dòng)纖維化的發(fā)生。早期研究[13]表明HSC能夠吞噬肝細(xì)胞的凋亡小體，誘導(dǎo)HSC中還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的激活，從而激活HSC。因此，HSC的激活離不開(kāi)肝內(nèi)細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子的作用。

2 單核/巨噬細(xì)胞與HSC的相互作用

2.1 HBV誘導(dǎo)抑制性單核/巨噬細(xì)胞 單核/巨噬細(xì)胞是一種異質(zhì)性的天然免疫細(xì)群，主要分為兩大類(lèi)，即“促炎性”的M1和“免疫調(diào)節(jié)性”的M2樣巨噬細(xì)胞。M1型細(xì)胞的主要功能是清除細(xì)菌、抗病毒以及釋放炎性細(xì)胞因子(TNF、IL-1、IL-12、ROS)；M2型細(xì)胞促進(jìn)組織纖維化、組織重塑、創(chuàng)傷愈合及分泌免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)(IL-10、TGFβ、IL-4)[14]。

臨床資料[15]顯示，HBV誘導(dǎo)的肝臟疾病與M2樣巨噬細(xì)胞高水平浸潤(rùn)有關(guān)。在慢性HBV感染者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)M2樣巨噬細(xì)胞積累，在急性HBV誘發(fā)的肝衰竭患者中，肝臟中M2樣巨噬細(xì)胞形成加速肝纖維化的發(fā)生。筆者在人源化小鼠HBV感染模型中已經(jīng)證實(shí)，HBV誘導(dǎo)的肝臟疾病和肝臟免疫損傷與M2樣巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生有關(guān)，HBV誘導(dǎo)M2樣巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為CD14highCD68highCD16lowCD163highCD206highIL-1RAhigh。同時(shí)，HBV誘導(dǎo)的M2樣巨噬細(xì)胞是強(qiáng)效的免疫抑制細(xì)胞，表達(dá)高水平的IL-10、共抑制分子(B7-H4)，下調(diào)IL-12、TNFα和共刺激分子(CD86)。進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)[16]表明，HBsAg和HBV通過(guò)TLR/MyD88/NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)單核細(xì)胞程序性死亡受體-配體1(PD-L1)、人類(lèi)白細(xì)胞抗原(HLA)-E及免疫調(diào)節(jié)因子表達(dá)。由此推測(cè)，HBV誘導(dǎo)的抑制性單核/巨噬細(xì)胞對(duì)HBV的持續(xù)感染以及肝纖維化的發(fā)生可能具有重要作用。

2.2 單核/巨噬細(xì)胞激活HSC 單核/巨噬細(xì)胞在慢性肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，被認(rèn)為是調(diào)節(jié)肝纖維化的潛在靶點(diǎn)。體外實(shí)驗(yàn)[17]顯示，HBV感染期間單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子和趨化因子，包括TNFα，IL-1β，TGFβ，單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP1)和趨化因子(CCL5)等，而單核/巨噬細(xì)胞分泌的CCL5通過(guò)NF-κB/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可誘導(dǎo)HSC活化，導(dǎo)致HSC炎癥分子[NOD樣受體蛋白3(NLRP3)、IL-1β、IL-6]和促纖維化基因的表達(dá)[18]。此外，HBV感染后優(yōu)先刺激肝臟巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促纖維化/抗炎性細(xì)胞因子TGFβ，而不是促炎性細(xì)胞因子IL-6，IL-1和TNFα[19]。眾所周知，TGFβ是激活肝臟HSC最有效的分子，TGFβ通過(guò)與HSC表面的TGFβ受體結(jié)合，誘導(dǎo)胞質(zhì)內(nèi)Smad2/Smad3復(fù)合物磷酸化，再與Smad4結(jié)合形成核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)分子，啟動(dòng)HSC促纖維化基因(α-SMA、Collagen Ⅰ、MMPs、TGFβ)的表達(dá)，導(dǎo)致膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)向胞外釋放引起肝纖維化的發(fā)生[17]。

2.3 HSC調(diào)節(jié)單核/巨噬細(xì)胞 HBV誘導(dǎo)單核細(xì)胞激活HSC后，活化的HSC反過(guò)來(lái)調(diào)節(jié)單核/巨噬細(xì)胞的分化及功能。活化的HSC誘導(dǎo)外周單核細(xì)胞以及肝內(nèi)單核細(xì)胞分化成為可分泌IL-10和TGFβ的具有免疫調(diào)節(jié)作用的單核細(xì)胞[20]?；罨腍SC促進(jìn)骨髓來(lái)源的免疫抑制性細(xì)胞(myeloid immunosuppressive cell，MDSC)的積累，尤其是單核來(lái)源的MDSC。活化的HSC通過(guò)COX2-PGE2-EP4信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)MDSC分化，用COX2抑制劑抑制PEG2的產(chǎn)生可顯著減少M(fèi)DSC的積累，而且活化的HSC誘導(dǎo)的MDSC通過(guò)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、精氨酸酶1和IL-4Rα發(fā)揮免疫抑制作用[21]。研究[22]報(bào)道，活化的HSC通過(guò)CD44依賴(lài)的方式誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞分化為CD14+HLA-DRlowMDSC， MDSC以精氨酸酶依賴(lài)性方式抑制T淋巴細(xì)胞增殖。除此之外，活化的HSC產(chǎn)生許多可溶性因子，如粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落生長(zhǎng)因子(GM-CSF)、單核細(xì)胞集落生長(zhǎng)因子(M-CSF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和C3都參與MDSC分化。

隨著研究的不斷探索，進(jìn)一步證實(shí)了活化的HSC免疫調(diào)節(jié)作用，將單核細(xì)胞與活化的HSC共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，活化的HSC可以上調(diào)單核細(xì)胞表面CD15和CCL2受體(CCR2)的表達(dá)，其中CCR2與免疫抑制性的M2表型有關(guān)[23]，上調(diào)免疫抑制細(xì)胞因子(IL-10、TGFβ1)的表達(dá)，下調(diào)炎癥細(xì)胞因子(TNFα、IL-1β)的產(chǎn)生[24]。這些研究結(jié)果顯示活化的HSC對(duì)單核細(xì)胞具有重新編程能力。

3 NK細(xì)胞與HSC的相互作用

3.1 HBV感染導(dǎo)致NK細(xì)胞功能障礙 NK細(xì)胞作為肝臟內(nèi)一類(lèi)重要的固有免疫細(xì)胞，約占肝臟內(nèi)淋巴細(xì)胞的30%[25]。眾所周知，外周血中NK細(xì)胞主要分為兩群，其中超過(guò)95%的是CD56dimCD16+NK細(xì)胞，其含有大量的細(xì)胞毒性顆?？汕宄w內(nèi)感染、衰老以及受損的細(xì)胞；而CD56brightCD16-NK細(xì)胞僅占5%左右，其細(xì)胞毒作用小，主要以分泌細(xì)胞因子為主，具有免疫調(diào)節(jié)功能[26-27]。

臨床數(shù)據(jù)[28]顯示，HBV慢性感染者血清中的外泌體內(nèi)含有HBV核酸和蛋白，NK細(xì)胞將含有HBV的外泌體攝入后，導(dǎo)致NK細(xì)胞IFNγ的產(chǎn)生、細(xì)胞毒作用、細(xì)胞增殖和存活等能力下降。與健康對(duì)照相比，慢性HBV患者體內(nèi)的NK細(xì)胞數(shù)量以及細(xì)胞因子的表達(dá)顯著降低[29]。同時(shí)，HBV感染后體內(nèi)高水平的IL-10是導(dǎo)致NK細(xì)胞功能缺陷的主要原因，阻斷IL-10或使用抗病毒治療藥物可恢復(fù)NK細(xì)胞的殺傷活力和IFNγ的產(chǎn)生[30]。HBV相關(guān)的免疫微環(huán)境抑制了NK細(xì)胞表面模式識(shí)別受體的表達(dá)，導(dǎo)致NF-κB和P38絲裂原活化蛋白激酶途徑被抑制，使NK細(xì)胞在清除HBV感染的肝細(xì)胞過(guò)程中出現(xiàn)功能障礙[31]。筆者實(shí)驗(yàn)[32]結(jié)果證明，HBV調(diào)節(jié)的單核細(xì)胞與NK細(xì)胞表達(dá)的程序性死亡受體(PD-1)、CD94通過(guò)受體-配體結(jié)合的方式相互作用，誘導(dǎo)NK細(xì)胞表達(dá)IL-10產(chǎn)生免疫抑制效應(yīng)。因此，在HBV感染期間NK細(xì)胞呈現(xiàn)功能失活的狀態(tài)，喪失對(duì)病毒感染的肝細(xì)胞以及衰老細(xì)胞的清除作用，促進(jìn)了肝臟疾病的發(fā)展。

3.2 NK細(xì)胞殺傷HSC 自2006年首次提出NK細(xì)胞對(duì)激活的HSC具有細(xì)胞毒作用以來(lái)，人們對(duì)NK細(xì)胞與HSC相互作用的機(jī)制進(jìn)行了廣泛的研究[32]。早期HBV感染，NK細(xì)胞通過(guò)各種不同的作用機(jī)制誘導(dǎo)活化的HSC凋亡從而控制纖維化的發(fā)生。首先必須明確，HBV不能直接作用于NK細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞的激活，而是在HBV作用的免疫微環(huán)境中借助其他細(xì)胞因子(IL-18、TNFα)誘導(dǎo)NK細(xì)胞的激活。激活的NK細(xì)胞通過(guò)TRAIL殺傷活化的HSC被認(rèn)為是NK細(xì)胞發(fā)揮抗纖維化作用的有效作用機(jī)制之一。同時(shí)，筆者[33]實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)IL-18和poly I∶C 協(xié)同作用激活NK細(xì)胞的P38/PI3K /AKT信號(hào)通路，誘導(dǎo)NK細(xì)胞IFNγ和TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體的表達(dá)增加，活化的NK細(xì)胞以TRAIL依賴(lài)的脫顆粒方式分泌穿孔素和顆粒酶B靶向殺傷活化的HSC[34]。但是，與早期HBV相關(guān)的肝纖維化患者相比，晚期患者NK細(xì)胞的激活受體表達(dá)、細(xì)胞因子和穿孔素的產(chǎn)生發(fā)生了明顯變化，其中NK細(xì)胞的數(shù)量、NKp46的表達(dá)、穿孔素和IFNγ的產(chǎn)生明顯降低，這些結(jié)果提示晚期患者肝內(nèi)NK細(xì)胞對(duì)活化的HSC殺傷作用降低，抗纖維化功能減弱[35]。

3.3 HSC調(diào)節(jié)NK細(xì)胞功能 迄今為止，對(duì)NK細(xì)胞的免疫特性以及肝纖維化過(guò)程中HSC對(duì)NK細(xì)胞調(diào)節(jié)的研究較少，特別是在慢性HBV感染相關(guān)的肝纖維化患者中。事實(shí)上，慢性肝損傷期間TGFβ通過(guò)下調(diào)NKG2D(CD314)和2B4(CD244)的表達(dá)抑制NK細(xì)胞的抗纖維化活性。在晚期肝纖維化中活化的HSC通過(guò)上調(diào)TGFβ的表達(dá)抑制NK細(xì)胞的脫顆粒作用以及IFNγ的產(chǎn)生，從而破壞NK細(xì)胞對(duì)HSC的殺傷作用[36]。HSC活化期間，視黃醇被代謝成維甲酸，維甲酸通過(guò)誘導(dǎo)HSC的細(xì)胞因子抑制信號(hào)1產(chǎn)生，抑制NK細(xì)胞的活力和IFNγ的產(chǎn)生[37]。近年來(lái)研究[38]發(fā)現(xiàn)，活化的HSC以內(nèi)吞的方式將功能受損的NK細(xì)胞吞入細(xì)胞內(nèi)，在HSC細(xì)胞內(nèi)溶酶體及各種水解酶作用下進(jìn)行消化，減少NK細(xì)胞的數(shù)量并且阻礙NK細(xì)胞的功能。因此，HBV感染期間，活化的HSC通過(guò)調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的功能促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展。

4 小結(jié)

HBV感染引起肝臟免疫應(yīng)答是由肝細(xì)胞、HSC、單核/巨噬細(xì)胞及NK細(xì)胞共同參與的反應(yīng)，它們?cè)诟闻K中通過(guò)雙向調(diào)節(jié)維持肝臟的免疫穩(wěn)態(tài)，控制纖維化的發(fā)生和修復(fù)。如圖1所示，HBV感染后形成的炎癥微環(huán)境，不僅引起免疫細(xì)胞的激活，而且激活HSC導(dǎo)致肝臟纖維化。NK細(xì)胞在肝臟中除了調(diào)控HBV感染，也可殺傷活化的HSC控制纖維化的發(fā)展。HSC誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為具有免疫抑制作用的調(diào)節(jié)細(xì)胞，誘導(dǎo)NK細(xì)胞功能障礙。綜上所述，HBV感染引起的肝纖維化不是某種細(xì)胞單獨(dú)作用的結(jié)果，而是多種細(xì)胞共同作用的結(jié)果，了解各個(gè)細(xì)胞之間的相互作用才能更好地預(yù)防和治療肝纖維化。

注：ECM，細(xì)胞外基質(zhì)；PDGF，血小板衍生生長(zhǎng)因子；COX2，環(huán)氧合酶2；GrzmB，顆粒酶B。

圖1HBV相關(guān)的肝細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和HSC之間的相互作用示意圖