徐 帥， 張立平

1 北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院 消化科， 北京 100078； 2 北京中醫(yī)藥大學， 北京 100029

外泌體產(chǎn)生于細胞中的多泡體，攜帶多種參與細胞內信號轉導的蛋白質、核酸、脂質等，可通過細胞膜受體直接激活受體細胞介導細胞間信息交流和調節(jié)細胞微環(huán)境，參與細胞生長、增殖，腫瘤發(fā)生和侵襲，抗病毒感染和細胞再生等病理生理過程。越來越多的研究表明，外泌體在肝臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。本文就外泌體與非腫瘤性肝臟疾病診療相關的最新研究進行綜述，以期為臨床診治提供新的思路。

1 外泌體的基本特性

外泌體是細胞分泌的細胞外囊泡之一，1983年首次由Pan和Johnstone發(fā)現(xiàn)于成熟的哺乳動物網(wǎng)織紅細胞中[1]。外泌體為脂質雙分子層架構，直徑為30～100 nm，密度為1.1～1.2 g/ml，電鏡下呈杯狀或球形，其大小、形狀和密度等受特定的蛋白質、脂質、酶和礦物質含量的影響，且在不同的囊泡之間存在較大差異[2]。外泌體主要來源于細胞內多囊泡體(multivesicular bodies，MVBs)，MVBs可以通過與溶酶體融合或與細胞膜融合而降解，其內容物被分泌出細胞膜[3]。外泌體可存在于人體多種體液中，如血液、尿液、唾液、羊水、母乳、胸水、腹水、膽汁等，大多數(shù)細胞如間充質干細胞、免疫細胞、神經(jīng)細胞、心肌細胞、內皮細胞等都可以產(chǎn)生并釋放外泌體。

外泌體富含各種蛋白質、脂質、DNA和RNA，參與人體多種生命活動[4]。最常見的蛋白質是四聚體蛋白(CD9、CD82、 CD81、CD63)，其中CD63和CD81是最為常用的特異性標志物。還富含與膜轉運和融合相關的蛋白(如GTPases)，MVB合成相關蛋白(如Alix、TSG101)，熱休克蛋白(如HSC70、HSC90)等[5]。最外層為附著于表面蛋白和某些外小葉脂質的糖基冠層，糖基冠層下面的外泌體膜含有膽固醇、神經(jīng)酰胺、鞘磷脂、糖磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酸等脂質[6]。外泌體中的核酸包括mRNA、microRNA(miRNA)、長鏈非編碼 RNA等，近年來，單鏈DNA和線粒體DNA也被證實存在于外泌體中[7]。

外泌體常用的提取方法有超速離心技術、尺寸排阻色譜法、超濾分離法、免疫親和捕獲方法、聚合物沉淀、微流體芯片分離技術[8]，由于每項技術都具有明顯的優(yōu)缺點，目前仍沒有一種方法能作為金標準。近年來，研究者[9]開發(fā)出針對不同樣本的商用外泌體提取試劑盒，能夠避免復雜的操作步驟和取得更高的純度和回收率。外泌體的具體功能與其所來源的細胞類型有關。在早期，人們認為外泌體主要起著處理細胞垃圾的作用，20世紀末才發(fā)現(xiàn)外泌體具有免疫調節(jié)和細胞間通訊的作用。他們參與免疫應答、細胞增殖、炎癥、凝血、泌乳和維持神經(jīng)功能等正常生理過程，同時還在肝臟疾病、神經(jīng)退行性疾病、癌癥以及移植物排斥反應等過程中發(fā)揮作用[10]。同時由于外泌體具有較小的分子結構、天然的分子轉運特性和良好的生物相容性，作為藥物遞送載體具有廣闊應用空間[11]。

2 外泌體與肝臟疾病的相關性

2.1 外泌體與病毒性肝炎 病毒性肝炎是嚴重影響人類健康的公共衛(wèi)生問題，主要以HBV和HCV感染為主。慢性病毒性肝炎反復遷延，可導致肝纖維化，并逐步進展為肝硬化和肝細胞癌。外泌體可通過轉運病毒相關分子促進細胞間的病毒感染，亦可通過細胞間的通信作用參與病毒感染后的免疫調控和抗病毒過程。

研究[12]表明HBV通過外泌體進入自然殺傷細胞(NK細胞)，抑制視黃酸誘導基因I的表達，并使NF-κB和p38信號通路失活而誘導NK細胞功能障礙。HBV感染肝細胞后，外泌體中免疫調節(jié)的miRNA水平升高，同時他們被轉移到巨噬細胞中，繼而抑制巨噬細胞中IL-12p35 mRNA的表達，抵抗宿主的先天免疫應答[13]。干擾素誘導的跨膜蛋白(interferon-induced transmembrane protein 2，IFITM2)是HBV宿主抗病毒治療的負調控因子，其作用于I型干擾素信號的上游，外泌體介導IFITM2從肝細胞到樹突狀細胞的轉運增強了IFITM2對內源性干擾素α合成的抑制作用，從而阻斷了外源性干擾素α的抗HBV作用[14]。

Karamichali等[15]發(fā)現(xiàn)外泌體能夠通過介導框內缺失突變體的轉移來調節(jié)HCV病毒復制并使病毒持續(xù)感染。HCV外泌體攜帶的miR-19a可以靶向肝星狀細胞(HSC)中細胞因子信號傳導3的抑制因子，導致信號傳導及轉錄激活蛋白3介導的TGFβ信號傳導激活，使促纖維化標志物高表達以及增強炎癥反應[16]。研究[17]發(fā)現(xiàn)HCV包膜糖蛋白E2可通過外泌體途徑釋放到細胞外且該過程受到syntenin蛋白的調控，E2包被的外泌體能夠幫助病毒逃逸抗體的中和。這些結果表明外泌體在病毒性肝炎的病毒傳播中起著重要作用，并且破壞宿主的先天免疫反應，使病毒持續(xù)感染，因此外泌體可作為病毒性肝炎潛在的分子標志物和治療手段。

2.2 外泌體與酒精性、非酒精性脂肪性肝病 肝臟是人體代謝的重要器官，在脂肪的消化、吸收、氧化、分解、合成和運輸中起著關鍵作用。在酒精性肝病(ALD)和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的肝損傷進展過程中，炎癥、血管生成失調和纖維化是關鍵環(huán)節(jié)，且相互之間密切相關。

研究[18]顯示ALD小鼠循環(huán)外泌體數(shù)量增加，接受ALD誘導外泌體的小鼠TNF、IL和單核細胞增多，而CD206、CD163比例下降，同時能夠激活HSP90從而誘導巨噬細胞活化。實驗[19-20]表明，對miR-155基因敲除小鼠進行酒精誘導，其肝臟脂肪變性、血漿ALT水平、氧化應激反應、自噬相關通路和蛋白明顯低于對照組小鼠，人體肝活檢亦表明ALD患者肝組織中miR-155的表達顯著增加。

NAFLD被認為是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)，脂毒性在其發(fā)展中具有重要作用，脂肪沉積是主要的病理特征。研究[21]發(fā)現(xiàn)非酒精性脂肪性肝炎(NASH)實驗模型中，從受損/應激肝細胞中釋放的肝細胞來源的細胞外囊泡通過激活肝內皮細胞、HSC、肝巨噬細胞等促進肝臟疾病的進展。巨噬細胞的M1促炎表型是NAFLD進展中的重要過程，研究[22]發(fā)現(xiàn)NAFLD患者的血清miR-192-5p水平與肝炎性活動評分和疾病進展呈正相關；NAFLD大鼠模型中，脂毒性肝細胞釋放出比對照組更多的富含miR-192-5p的外泌體，誘導M1巨噬細胞(CD11b+/CD86+)活化并增加誘導型一氧化氮合酶、IL-6和TNFα的表達，誘導脂肪變性的肝臟發(fā)生炎癥損傷。

2.3 外泌體與肝纖維化 肝纖維化是由很多因素引起的慢性肝損傷的傷口愈合反應，HSC活化是導致肝纖維化的主要原因。研究[23]發(fā)現(xiàn)有氧糖酵解對于將靜息HSC重編程為活化的HSC至關重要，來自缺氧誘導因子1介導的活性HSC分泌外泌體，傳遞特異性糖酵解相關蛋白GLUT1和PKM2，它們在活化HSC的衍生外泌體中表達增加，并誘導靜止的HSC產(chǎn)生Warburg效應。外泌體釋放被阻斷時，HSC的激活和糖酵解被抑制，提示外泌體可能通過調節(jié)糖酵解影響肝臟非實質細胞之間的代謝轉換。對自噬與肝纖維化的研究[24]發(fā)現(xiàn)，應激升高的TRIB3與SQSTM1相互作用，干擾SQSTM1在肝實質細胞中的功能并激活HSC而促進肝纖維化，因此靶向TRIB3-SQSTM1相互作用也為治療纖維增生性肝病提供了新思路。外泌體RNA在HSC活化過程中也發(fā)揮重要作用。研究[25]發(fā)現(xiàn)含miR-192的外泌體數(shù)量通過HCV復制而增加，它們從病毒復制的肝細胞中釋放出來，然后被傳遞到HSC中，激活和誘導細胞分化，同時促進人原發(fā)性肝干細胞向肌成纖維細胞的轉化。肝細胞外泌體MALAT1通過miR-26b參與亞砷酸鹽誘導的纖維化過程中HSC的活化[26]。肝纖維化還受到結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CCN2)的控制，體內研究[27]表明，來源于原代小鼠活化 HSC的外泌體中CCN2 增加，利用從活化 HSC中分離的外泌體孵育靜態(tài) HSC，可促進CCN2 和α平滑肌肌動蛋白的高表達。另有體外實驗[28]表明，膽管細胞來源的外泌體H19通過促進HSC活化和增殖，在膽汁淤積性肝纖維化進展中發(fā)揮作用，無論是小鼠膽汁淤積性肝損傷模型，還是原發(fā)性硬化性膽管炎和原發(fā)性膽汁性膽管炎患者，血清外泌體H19水平與肝纖維化嚴重程度相關。

2.4 外泌體與肝損傷 肝損傷可由多種理化及生物因素導致，可出現(xiàn)多種肝臟疾病的臨床表現(xiàn)，個體之間發(fā)病時間差異較大。由于我國人口基數(shù)龐大，各地醫(yī)療水平發(fā)展不均，部分地區(qū)存在用藥不當以及人們對藥物安全性問題的認知不夠，藥物性肝損傷(DILI)發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢，嚴重者可導致急性肝衰竭。因此對肝損傷進行早期診斷、控制病情進展、減少肝衰竭發(fā)生是至關重要的。

研究[29]發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞釋放的脂多糖(LPS)誘導的外泌體通過調節(jié)核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎性小體通路的激活參與膿毒癥導致的急性肝損傷過程，與正常對照組相比，注射LPS外泌體的小鼠ALT、AST和乳酸脫氫酶水平升高，肝臟有大范圍的炎癥細胞浸潤。在對乙酰氨基酚(APAP)所致肝損傷小鼠的研究[30]中發(fā)現(xiàn)，實驗組小鼠外泌體肝特異性蛋白精氨酸酶-1水平高于對照組，且APAP衍生的外泌體提高了與細胞毒性相關的mRNA轉錄的表達，激活激酶介導的原代肝細胞和各種肝癌細胞的細胞死亡信號，導致肝細胞增殖減少。另一項關于APAP誘導肝損傷的研究[31]表明，外泌體miR-122a-5p、miR-192-5p、miR-193a-3p和miR-194-5p的表達水平在肝組織中顯著下調，而在血清中同時上調，這可能是由于肝損傷導致miRNA釋放到循環(huán)中，同時miRNA-193a-3p在給藥后12 h即顯著升高。在氯吡格雷處理的HepG2細胞中分別觀察到miR-26a-5p的上調和miR-15b-5p的下調及其靶mRNAs表達異常，且該變化與血清AST、ALT變化沒有相關性[32]。由此可見外泌體miRNA表達的變化或許可作為藥物性肝損傷的早期標志物。

3 外泌體作為肝臟疾病診斷和預后的潛在標志物作用

對于肝臟疾病的診斷，早期以血液標志物檢測和影像學檢查等方法為主，雖具較高診療價值，但相對缺乏敏感性和特異性。肝活檢作為一種侵入性檢查手段具有一定局限性。尋找針對肝臟疾病早期、無創(chuàng)的診療方法具有重要意義。外泌體存在于多種體液中，含有反映細胞功能和條件的各種特定類型的蛋白質、核酸等，可作為包括急性和慢性肝病在內的多種疾病的潛在生物標志物，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種miRNA與肝臟疾病有關。

miR-122是目前研究最充分的肝臟特異性miRNA，參與多種肝臟生理病理過程。有報道[33]內源性miR-122的下調可增強HBV復制，而miR-122上調則導致HBV抑制。此外，循環(huán)miR-122在慢性乙型肝炎患者中被發(fā)現(xiàn)與ALT和HBV DNA水平呈正相關，這意味著循環(huán)miR-122水平有可能反映肝損傷和病毒感染的程度，并可能進一步影響抗病毒治療的預后。通過測定血清miR-122水平的動態(tài)變化表明miR-122在第12和24周的變化可能成為核苷(酸)類藥物治療慢性乙型肝炎患者病毒應答的獨立預測因子。另有研究[34]發(fā)現(xiàn)，ALT水平正常但有嚴重肝損傷患者的血漿miR-122水平顯著高于對照組，同時miR-151a-3p水平明顯低于對照組，因此可以提前識別部分正在經(jīng)歷肝損傷但ALT水平正常的患者。

研究[35]發(fā)現(xiàn)與早期NAFLD患者相比，晚期NAFLD患者血清中循環(huán)外泌體miR-192的水平升高，表明miR-192可能是NASH進展相關的潛在生物標志物。與原發(fā)性肝癌患者相比，轉移性肝腫瘤中miR-1246和miR-210的表達水平顯著升高，因此miR-1246和miR-210可以作為區(qū)分肝細胞癌和肝轉移瘤的潛在生物標志物[36]。

急性細胞排斥反應是肝移植術后的主要問題，對肝移植術后患者觀察發(fā)現(xiàn)，半乳糖凝集素9在發(fā)生急性細胞排斥反應患者的循環(huán)外泌體和切除的肝臟中均表達增高[37]，說明外泌體衍生的半乳糖凝集素9水平可能是肝移植后排斥反應和預后的預測因子。

4 外泌體在肝臟疾病治療中的作用

外泌體因其可由多種細胞分泌，能夠直接轉移多種細胞生物活性分子包括mRNAs、miRNA等，已經(jīng)報道其在糾正代謝缺陷、改善肝功能、促進肝臟再生、預防腫瘤進展等方面對肝臟疾病具有潛在的治療作用。除直接治療作用外，外泌體還能夠作為載體將特異性生物分子遞送至靶細胞發(fā)揮其生物學效應。

間充質干細胞移植作為慢性肝病的一種新興療法越來越受到人們的關注，外泌體在治療過程中發(fā)揮關鍵作用。研究[38]表明羊膜來源間充質干細胞來源的外泌體能夠顯著減少NASH大鼠Kupffer細胞的數(shù)量以及TNFα、IL-1β、IL- 6和TGFβ等炎癥因子的mRNA表達水平，還顯著降低了肝纖維化大鼠的纖維積累、Kupffer細胞數(shù)，抑制HSC活化。間充質干細胞外泌體能夠減輕肝臟缺血再灌注損傷，實驗組炎癥標志物、肝組織凋亡標志物caspase-3、bax水平明顯低于對照組[39]。肝細胞來源的外泌體能夠促進肝細胞增殖和肝再生，而從Kupffer細胞或內皮細胞分離的外泌體則無此作用[40]。另有研究[41]發(fā)現(xiàn)，在自身免疫性肝炎實驗模型中，NLRP3及caspase-1蛋白的表達增高，骨髓干細胞來源的外泌體具有保護肝損傷的作用，miR-223能夠降低NLRP3及caspase-1蛋白的表達，這可能為自身免疫性肝炎的治療提供一定的方向和依據(jù)。脂肪間充質干細胞外泌體通過miR-17靶向硫氧還蛋白相互作用蛋白并抑制異?；罨木奘杉毎坝蒐PS或TNFα誘導的炎癥體激活，而發(fā)揮對急性肝衰竭的治療作用[42]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種新型基因編輯技術，對HBV的研究發(fā)現(xiàn)轉染了CRISPR/Cas9表達質粒的細胞產(chǎn)生的外泌體中存在完整的功能性gRNA和Cas9蛋白，且CRISPR/Cas9系統(tǒng)可通過外泌體傳遞gRNA和Cas9蛋白至周圍的細胞內，發(fā)揮其基因編輯功能[43]。這一作用雖然可以避免病毒載體系統(tǒng)本身帶來的副作用，但由于外泌體的釋放可能通過細胞間通訊影響周圍和遠端組織或細胞，使得脫靶效應和安全性問題更加復雜化。

5 結語和展望

外泌體作為一種大多數(shù)細胞類型產(chǎn)生的細胞外小泡，其介導的細胞間通訊通過將各種生物活性成分從供體細胞轉移到靶細胞來調節(jié)各種細胞功能，可作為診斷和預后的有效生物標志物，以及藥物和基因靶向傳遞的載體。其在肝臟炎癥、肝纖維化、肝硬化及肝衰竭這一系列病理過程中均發(fā)揮重要作用。血清外泌體有望作為肝臟疾病的液體活檢，代替有創(chuàng)的肝組織活檢。盡管外泌體的應用潛力巨大，目前仍存在一定的問題，例如沒有標準化的分離方法，常用分離方法存在過程耗時、產(chǎn)量較低、容易污染的問題。另外，關于外泌體的生物發(fā)生、釋放、靶向及與靶細胞相互作用的確切機制仍需進一步深入探索，才能更好的將其應用于臨床和研究當中。