馬艷弘 ，孟 勇 ，崔 晉 ，張宏志 ，曹培杰 ，孟 超

（1. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2. 徐州世緣食品有限公司，江蘇 徐州 221723）

牛蒡（Arctium lappa L.）又名大力子、蒡翁菜、牛菜等，是公認(rèn)的食藥同源性蔬菜。 年蒡含蛋白質(zhì)、多種氨基酸、微量元素、維生素等，還含有菊糖、綠原酸、牛蒡苷、膳食纖維、多酚等生物活性成分[1-3]，具有清除氧自由基，提高人體免疫力等多種保健功效[4-6]，其營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，開發(fā)應(yīng)用前景廣闊。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)牛蒡的研究主要集中在牛蒡苷、木脂素、菊糖等物質(zhì)的檢測(cè)、分析，分離和純化及其功能鑒定等方面[7-9]。 多酚是牛蒡生物保健功能的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一[10-12]，其提取方法包括溶劑提取、酶法輔助提取、微波輔助提取、超聲提取等方法。 采用超聲輔助酶法提取活性物質(zhì)的提取時(shí)間短、提取效率高、而且產(chǎn)物易純化，已廣泛應(yīng)用于花色苷、蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)的高效制備[13-15]，但有關(guān)牛蒡多酚超聲輔助酶法提取的研究鮮見報(bào)道。 作者采用超聲輔助纖維素酶法提取牛蒡多酚，優(yōu)化其提取工藝并探討提取物的抗氧化活性，為拓寬牛蒡加工途徑、延長(zhǎng)產(chǎn)業(yè)鏈、實(shí)現(xiàn)牛蒡多酚的產(chǎn)業(yè)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛蒡：徐州世緣食品有限公司提供。 牛蒡清洗干凈后置于恒溫干燥箱60℃干燥至恒重，粉碎過篩，低溫保藏備用。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：上海源葉生物科技公司產(chǎn)品；羥自由基測(cè)定試劑盒、抗超氧陰離子自由基測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；苯酚、無水乙醇、檸檬酸、鹽酸、氯化鉀等試劑為分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-2500E 超聲波機(jī)：昆山禾創(chuàng)儀器公司產(chǎn)品；真空冷凍干燥機(jī)：美國(guó)Thermo 公司產(chǎn)品； RE5220型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；D-8 紫外分光光度計(jì)：南京菲勒儀器有限公司產(chǎn)品；MJ-BL15U11破壁攪拌機(jī)：廣東美的電器制造有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 牛蒡多酚提取工藝 牛蒡粉稱重，加入乙醇溶液，置于450 W 功率下進(jìn)行超聲處理，然后按比例加入纖維素酶，恒溫提取一段時(shí)間，4 500 r/min離心 15～20 min，分離上清，將沉淀再提取 1 次，2 次提取所得上清即為多酚提取液。 濃縮提取液，通過大孔樹脂AB-8 進(jìn)行純化，經(jīng)乙醇溶液洗脫、濃縮，冷干，即得牛蒡多酚。

1.3.2 總酚的測(cè)定 福林酚比色法測(cè)定多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)[16]，以沒食子酸為標(biāo)品制標(biāo)曲，分別加入5 mL蒸餾水，1 mL FC 試劑和3 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.5% Na2CO3溶液，45 ℃水浴加熱 90 min 后，在波長(zhǎng) 760 nm 處測(cè)吸光度，得到?jīng)]食子酸質(zhì)量濃度與吸光度的回歸方程：y=0.005 3x - 0.015 2（R2=0.998 9），據(jù)此標(biāo)曲計(jì)算牛蒡多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)（按沒食子酸計(jì)），再按照公式（1）計(jì)算其多酚得率Y。

式中：Y 為多酚得率，（mg/g）；C 為多酚質(zhì)量濃度，（mg/mL）；V 為提取液的總體積，（mL）；m 為牛蒡粉質(zhì)量，（g）。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（30 %、40 %、50 %、60 %、70 %）、不同液料體積質(zhì)量比（5、10、15、20、25 mL/g）、不同超聲波時(shí)間（3、6、9、12、15 min）、不同纖維素酶質(zhì)量濃度（0.5、1、1.5、2、2.5 mg/mL）、不同酶解溫度（45、50、55、60、65 ℃）、不同酶解時(shí)間（30、45、60、75、90 min）等 6 個(gè)因素對(duì)多酚提取率的影響，根據(jù)結(jié)果確定適宜的提取條件。

1.3.4 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析 采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)方案，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù) （A）、 纖維素酶質(zhì)量濃度/（mg/mL）（B）、酶解時(shí)間/min（C）、酶解溫度/℃（D）為考察因素，以牛蒡多酚得率為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.05 軟件優(yōu)化工藝參數(shù)。 因素水平見表1。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平編碼表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

1.3.5 牛蒡多酚抗氧化活性分析[17-18]

1）牛蒡多酚對(duì)DPPH 自由基清除能力測(cè)定 配置0.05 mg/mL 的DPPH 自由基溶液，取不同體積的多酚溶液，加去氧水補(bǔ)足1 mL，分別加入5 mL DPPH溶液，混合均勻后避光反應(yīng)30 min，用分光光度計(jì)分別測(cè)定517 nm 處的吸光度值A(chǔ)1，5 mL DPPH溶液與1 mL 無水乙醇混合后測(cè)得的吸光度值A(chǔ)0，5 mL無水乙醇與1 mL 多酚溶液混合后測(cè)得的吸光度值A(chǔ)2。 按照公式（2）計(jì)算 DPPH 自由基清除率。

式中：A1為樣品管吸光度值；A2為對(duì)照管吸光度值；A0為空白管吸光度值。

2）牛蒡多酚抗超氧陰離子自由基能力測(cè)定 按照試劑盒說明書，分別取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的多酚溶液及同質(zhì)量濃度VC 溶液，測(cè)定550 nm 處的吸光度值。 對(duì)照組用無水乙醇代替樣品，按照式（3）計(jì)算抗超氧陰離子自由基活力單位。

式（3）中：A1為樣品管吸光度值；A2為對(duì)照管吸光度值；A0為標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值。

3）牛蒡多酚清除羥自由基能力測(cè)定 按照試劑盒說明書操作，分別取500 μL 不同質(zhì)量濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL）的多酚溶液和 VC 溶液，測(cè)定550 nm 處的吸光值。 按照式（4）計(jì)算羥自由基清除率。

式中：A1為試驗(yàn)管吸光度值；A0為對(duì)照管吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛蒡多酚提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)牛蒡多酚提取量的影響 由圖1 可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在30%～50%之間，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，多酚提取率逐漸提高，在乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%時(shí)，多酚的提取率達(dá)到最大值23.78 mg/g；乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%～60%之間，多酚得率變化平緩；乙醇體積分?jǐn)?shù)大于60%，多酚得率隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高反而下降。 這是由于高體積分?jǐn)?shù)提取溶劑會(huì)引起細(xì)胞蛋白質(zhì)變性，間接影響多酚溶出，最終導(dǎo)致了得率的降低[19]。因此選擇乙醇的適宜體積分?jǐn)?shù)為50%。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚得率的影響Fig. 1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of polyphenols from burdock

2.1.2 液料體積質(zhì)量比對(duì)牛蒡多酚提取量的影響由圖2 可知，多酚得率會(huì)隨液料體積質(zhì)量比的增加而逐漸增大，在20 mL/g 時(shí)，提取率達(dá)到峰值25.52 mg/g，之后再增大液料體積質(zhì)量比，多酚得率變化平緩，表明20 mL/g 的液料體積質(zhì)量比即可使多酚溶出達(dá)到平衡，由此將20 mL/g 確定為牛蒡多酚的最佳液料體積質(zhì)量比。

圖2 液料體積質(zhì)量比對(duì)多酚得率的影響Fig. 2 Effect of solid to liquid radio on extraction rate of polyphenols from burdock

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)牛蒡多酚提取量的影響

圖3 可見，3～6 min 范圍內(nèi)多酚得率隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)而提高，到6 min 時(shí)，提取率達(dá)到最大（29.68 mg/g），這是由于 6 min 內(nèi)，超聲的空化效應(yīng)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，細(xì)胞破壞程度增大，從而導(dǎo)致多酚溶出、得率提高；超過6 min 后多酚得率開始下降，是由于長(zhǎng)時(shí)間的超聲波作用引起了多酚的共價(jià)鍵斷裂進(jìn)而引發(fā)了多酚的降解，因此，確定適宜的超聲時(shí)間為6 min。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)多酚得率的影響Fig. 3 Effect of ultrasonic time on extraction rate of polyphenols from burdock

2.1.4 纖維素酶量對(duì)牛蒡多酚提取量的影響 由圖 4 可見，在 0.5～1.0 mg/mL 添加范圍內(nèi)，隨著纖維素酶用量的加大，多酚得率也明顯提高，當(dāng)酶用量為1.0 mg/mL 時(shí)，多酚得率達(dá)到最大值39.03 mg/g。之后繼續(xù)提高酶的用量，多酚得率反而降低。 表明適量纖維素酶的添加有利于破壞牛蒡的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)多酚的溶出效率，但是酶用量過多，會(huì)導(dǎo)致溶劑粘度增高、阻塞細(xì)胞內(nèi)含物的溶出通道，從而導(dǎo)致其提取率的下降。

圖4 纖維素酶質(zhì)量濃度對(duì)多酚得率的影響Fig. 4 Effect of cellulase concentration on extraction rate of polyphenols from burdock

2.1.5 酶解溫度對(duì)牛蒡多酚得率的影響 由圖5可知，酶解溫度在45～50 ℃之間，多酚得率隨酶解溫度的升高而升高，在酶解溫度達(dá)到50 ℃時(shí)達(dá)到峰值38.05 mg/g； 而多酚得率在55～60 ℃之間則基本趨于穩(wěn)定；超過60℃后，多酚得率反而下降。 表明溫度過高會(huì)使酶蛋白變性，酶活性降低，從而導(dǎo)致多酚提取率降低。 由此確定牛蒡多酚的適宜酶解溫度為50℃。

圖5 酶解溫度對(duì)多酚得率的影響Fig. 5 Effect of cellulase reaction temperature on polyphenols yield from burdock

2.1.6 酶解時(shí)間對(duì)牛蒡多酚提取量的影響 從圖6可以看出，酶解時(shí)間在30～75 min 之間，酶解時(shí)間越長(zhǎng)，多酚得率越高，在75 min 時(shí)多酚得率達(dá)到最大（39.71 mg/g），大于75 min 后多酚提取率反而下降。這是由于適宜的反應(yīng)時(shí)間能夠促使底物和酶接觸充分，進(jìn)而提高了牛酚得率。 由此可確定75 min 為牛蒡多酚的最佳酶解時(shí)間。

圖6 酶解時(shí)間對(duì)多酚得率的影響Fig. 6 Effect of cellulase reaction time on polyphenols yield from burdock

2.2 牛蒡多酚提取條件響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 回歸模型建立與顯著性檢驗(yàn) 根據(jù)Boxbehnken 的中心組合設(shè)計(jì)原則，以多酚得率為響應(yīng)值，優(yōu)化牛蒡多酚的提取工藝。 結(jié)果見表2。 利用Design Expert8.05 軟件對(duì)表中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到響應(yīng)值對(duì)幾個(gè)自變量的回歸方程為：

Y=41.21-0.21A+1.75B-0.40C+0.29D-0.53AB-1.13AC+1.13AD+0.99BC+0.50BD+1.28CD-0.55A2-2.571B2-1.46C2-1.00D2

表2 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

由方差分析結(jié)果表3 可知，該回歸模型高度顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)（P=0.092 8）不顯著，表明試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值高度相關(guān)模型與實(shí)驗(yàn)擬合良好，該模型可以反應(yīng)牛蒡多酚得率的預(yù)測(cè)與分析[20]。表3 還反應(yīng)了4 個(gè)自變量對(duì)響應(yīng)值多酚得率的影響程度，其影響大小排序依次為纖維素酶質(zhì)量濃度（B）＞酶解時(shí)間（C）＞酶解溫度（D）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（A），其中因素C 對(duì)多酚得率影響顯著（P＜0.05），因素 B 和 AC、AD、BC、CD 的交互作用對(duì)多酚得率的影響極顯著（P＜0.01）。

表3 方差分析表Table 3 The table of variance analysis

2.2.2 牛蒡多酚提取量響應(yīng)面分析與優(yōu)化 圖7反映了兩兩因素間的交互作用對(duì)牛蒡多酚提取量的影響情況。 曲面越陡，表明變量對(duì)多酚得率影響越大[21]。 由圖可見，除乙醇體積分?jǐn)?shù)與酶質(zhì)量濃度（AB）、酶質(zhì)量濃度與酶解溫度（BD）的交互作用對(duì)提取量的影響不顯著（P＞0.05）外，乙醇體積分?jǐn)?shù)與酶解時(shí)間（AC）、乙醇體積分?jǐn)?shù)與酶解溫度（AD）、酶質(zhì)量濃度與酶解時(shí)間（BC）、酶解溫度與時(shí)間（CD）的互作效應(yīng)對(duì)牛蒡多酚得率的影響極顯著 （P＜0.01）。經(jīng)軟件分析，得到的最佳提取參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)43.68%、纖維素酶質(zhì)量濃度1.24 mg/mL、酶解時(shí)間79.81 min、酶解溫度50.56 ℃，此條件下牛蒡多酚得率為41.65 mg/g。經(jīng)綜合考慮，修正為：乙醇體積分?jǐn)?shù)45%、纖維素酶質(zhì)量濃度1.25 mg/mL、酶解時(shí)間80 min、酶解溫度50 ℃。 經(jīng)驗(yàn)證，此條件下多酚提取率為41.33 mg/g，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值相對(duì)偏差在0.76%左右，證明該模型可用于預(yù)測(cè)牛蒡多酚提取狀況。

2.2.3 超聲波輔助纖維素酶法與其他提取方法的比較 比較超聲輔助酶法提取方法、 超聲提取、酶法提取方法對(duì)牛蒡多酚提取量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種方法的多酚得率分別為 41.33、29.67、33.03 mg/g，超聲輔助酶法提取的多酚得率比其他2 種方法分別提高了39.30 %、25.13 %。 這是由于一方面纖維素酶可破壞牛蒡細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，促使多酚外溢；另一方面，超聲波的空化效應(yīng)和振動(dòng)作用，也能促使牛蒡細(xì)胞破裂，導(dǎo)致多酚從細(xì)胞中溶出；同時(shí)，短時(shí)間的超聲處理還能夠促進(jìn)酶分子空間構(gòu)象發(fā)生變化、加速底物與酶的接觸，從而增強(qiáng)纖維素酶活力、提高酶解效率[22-24]。

圖7 各因素交互作用影響牛蒡多酚提取量的響應(yīng)面圖Fig. 7 Response surface plot showing the effects of ethanol concentration, cellulase concentration,cellulase reaction temperature, and time on the yield of polyphenols from burdock

2.3 牛蒡多酚抗氧化活性分析

2.3.1 牛蒡多酚對(duì)DPPH 自由基的清除作用 如圖8 所示，牛蒡多酚的DPPH 自由基清除率隨其質(zhì)量濃度的提高而逐漸增強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH 自由基的清除率達(dá)最大（55.66%），與同質(zhì)量濃度VC 溶液對(duì) DPPH 自由基的清除率（55.81%）相比并無差異，表明牛蒡多酚具有很強(qiáng)的DPPH 自由基清除能力。

圖8 牛蒡多酚的DPPH 自由基清除能力Fig. 8 DPPH radical scavenging capacity of polyphenols from burdock

2.3.2 牛蒡多酚的抗超氧陰離子活力 如圖9 所示，牛蒡多酚的抗超氧陰離子自由基能力隨著多酚質(zhì)量濃度增大而增強(qiáng)，但是略低于同質(zhì)量濃度VC的抗超氧陰離子活力。

圖9 牛蒡多酚的抗超氧陰離子自由基能力Fig. 9 Superoxide anion radical scavenging capacity of polyphenols from burdock

圖10 牛蒡多酚的羥自由基清除能力Fig. 10 Hydroxyl radical scavenging capacity of polyphenols from burdock

2.3.3 牛蒡多酚對(duì)羥自由基的清除作用 由圖10可示，牛蒡多酚對(duì)羥自由基的清除率隨著多酚質(zhì)量濃度提高而增強(qiáng)，具有明顯的量效關(guān)系。 但牛蒡多酚對(duì)羥自由基的清除效果明顯低于同質(zhì)量濃度的VC。

3 結(jié) 語

以多酚提取率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化了牛蒡多酚超聲輔助酶法提取工藝，建立的牛蒡多酚預(yù)測(cè)模型為Y= 41.21-0.21A+ 1.75B- 0.40C+ 0.29D- 0.53AB- 1.13AC+1.13AD + 0.99BC + 0.50BD + 1.28CD - 0.55A2-2.571B2- 1.46C2-1.00D2，最優(yōu)提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)45%、液料體積質(zhì)量比20 mL/g、450 W 超聲功率下超聲處理6 min，纖維素酶質(zhì)量濃度1.25 mg/mL、酶解時(shí)間80 min、酶解溫度50 ℃。 此條件下牛蒡多酚的提取量最大，達(dá)41.33 mg/g，比超聲波輔助法和纖維素酶法分別的多酚得率分別提高了39.30%、25.13%。

通過檢測(cè)牛蒡多酚的DPPH 自由基清除能力、抗超氧陰離子自由基能力、 羥自由基清除能力發(fā)現(xiàn)，所提牛蒡多酚具有較強(qiáng)的抗氧化活性，其對(duì)DPPH 自由基的清除作用最強(qiáng)，對(duì)羥基自由基的清除作用較弱。